ترایزول

محلول ترایزول جهت جداسازی RNA از سلول ها و یا محلول های بیولوژیک می باشد. این محلول طی یک مرحله قادر به جداسازی RNA می باشد.در واقع ترایزول یک محلول بر پایه گوانیدیوم می باشد که بر اساس متود چامشنسکی و ساچی تغییر یافته است. از جمله مزایای این محلول می توان به مدت زمان کم استخراج و حساسیت بالای آن برای مقادیر کم ترانسکریپ می باشد.

نگهداری

1شرایط نگهداری در دمای 2-8 درجه سانتیگراد است.

حجم های قابل عرضه

125 میلی لیتر
250 میلی لیتر
3100 میلی لیتر

پروتکل استفاده از ترایزول

1افزودن ترایزول
برای هر 250 میکرولیتر از پلاسما یا هر فلاسک کشت سلول T25 به مقدار 1000 میکرولیتر ترایزول اضافه نمایید.
2هموژنایز نمودن
سوسپانسیون را با پیپتاژ کردن آ و سپس با استفاده از سرنگ 20 G حداقل برای 30 مرتبه هموژنایز کرده. حالا هر 1 میلی لیتر از هموژنات را به 1 میکروتیوب 1.5 میلی لیتری افزوده. نکته: نمونه هموژنایز شده می تواند در دمای منفی 80 درجه به مدت حداقل 1 ماه دوام بیاورد.
3انکوباسیون
نمونه هموژنایز شده را به مدت حداقل 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه نموده تا مطمئن شوید که جداسازی کامل کمپلکس نوکلئوپروتئینی صورت گرفته است.
4افزودن کلروفرم
به هر میکروتیوب 200 میکرولیتر کلروفرم افزوده
5شیکینگ
درب میکروتیوب را بسته و محکم آن را به مدت 15 ثانیه تکان دهید
6انکوباسیون
در دمای اتاق به مدت 2-15 دقیقه انکوبه شود.
7سانتریفیوژ
در دمای 2-8 درجه سانتیگراد و به مدت 15 دقیقه در 12000g سانتریفیوژ شود. در صورتی که سوسپانسیون سلولی استفاده می شود بهتر است که استخراج با کلروفرم 2 بار تکرار شود. بدین منظور ، فاز مایع بالایی را به یک میکروتیوب 1.5 میلی لیتری انتقال داده و هم حجم آن کلروفرم اضافه نموده و مراحل 5-7 را تکرار نموده
8جداسازی فاز مایع
فاز مایع بالایی را به یک میکروتیوب 1.5 میلی لیتری منتقل نموده ( معمولا 60 درصد حجم کل محلول می باشد). پیشنهاد: 5 میکرولیتر RNA Binder اضافه نموده.(-Glycogen MB, N-1151) این کار به ته نشینی RNA در ته ظرف کمک می کند.
9افزودن ایزوپروپانول
500 میکرولیتر ایزوپروپانول به فاز مایع اضافه نموده (این کار به رسوب نمودن RNA از فاز مایع کمک می کند).
10ورتکس کردن
محلول را به مدت 10 ثانیه ورتکس کرده
11انکوباسیون
به مدت 10 دقیقه در دمای 15-25 درجه نمونه ها را انکوبه نمایید . این کار موجب کامل سدن رسوب RNA می شود.
12سانتریفیوژ
در دمای 2-8 درجه سانتیگراد و به مدت 10 دقیقه در 12000g سانتریفیوژ شود.
13جداسازی
سوپ رویی را دور ریخته
14افزودن اتانول
1 میلی لیتر اتانول 75 درصد نوکلئاز فری به هر میکروتیوب اضافه نموده. لازم است که از آب تیمار شده با DEPC برای تهیه اتانول استفاده شود.
15سانتریفیوژ
در دمای 2-8 درجه سانتیگراد و به مدت 5 دقیقه در 7500g سانتریفیوژ شود.
16جداسازی
سوپ رویی را دور ریخته
17تکرار
مراحل 14-16 را تکرار کنید
18خارج نمودن اتانول
با استفاده از وکیوم یا خشک کردن با هوا به مدت 5-10 دقیقه اتانول را خارج نمایید. نکته: رسوب RNA را با سانتریفیوژ تحت خلا خارج نکنید. نباید محلول کاملا خشک شود چرا که رسوبات قابلیت حل مجدد ضعیف تری خواهند داشت.
19افزودن آب فاقد نوکلئاز
20 میکرولیتر آب فاقد نوکلئاز دارای PH 7.5 به رسوب RNA اضافه نمایید.
20حل کردن RNA
RNA را با ورتکس نمودن به مدت 10 ثانیه حل نمایید.
21انکوباسیون
به مدت 10 دقیقه در دمای 55-60 درجه سانتیگراد انکوباسیون نمایید. نهایتا ممکن است RNA بلافاصله برای تکثیر استفاده شود یا اینکه در دمای 80- درجه نگه داری شود.
English