إيجابيات وسلبيات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هي تقنية تستخدم على نطاق واسع في الطب وأبحاث البيولوجيا الجزيئية لتوليد نسخ عديدة من قسم معين من الحمض النووي، مثل جين معين. إنه يخدم أغراضا مختلفة، بما في ذلك معالجة الحمض النووي الأولية للتسلسل وإنشاء ملفات تعريف الحمض النووي الجنائي من كميات ضئيلة من الحمض النووي. يسهل تفاعل البوليميراز المتسلسل أيضا تحديد مسببات الأمراض أثناء العدوى من خلال الكشف عن وجود أو غياب جينات معينة. على سبيل المثال، أثناء جائحة كوفيد-19، حددت اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل ما إذا كانت عينة مسحة الشخص تحتوي على جزء من المادة الوراثية للفيروس، مما يوفر نتيجة إصابة إيجابية أو سلبية.

تم تطوير تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة الكيميائي الحيوي الأمريكي كاري موليس في عام 1983 أثناء عمله في شركة Cetus Corporation، وهو طريقة تستخدم بشكل روتيني لتضخيم عينة معينة من الحمض النووي بسرعة، مما يتيح للعلماء زيادة كمية الحمض النووي للدراسة الشاملة. تلعب هذه التقنية دورا حاسما في مجموعة واسعة من الاختبارات الجينية وطرق البحث، بما في ذلك تحليل عينات الحمض النووي القديمة والكشف عن الكائنات المعدية. تتضمن تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل سلسلة من دورات تغيير درجة الحرارة التي تعمل على تضخيم كميات ضئيلة من تسلسلات الحمض النووي بشكل كبير. وتمتد تطبيقاتها إلى مجالات مختلفة، مثل البحث البيولوجي والطب الشرعي الجنائي، مما يجعل تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل أداة مستخدمة بشكل متكرر في أبحاث المختبرات الطبية.

تعتبر تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل ضرورية للاختبارات والتحليلات الجينية، بما في ذلك تحديد الكائنات المعدية وتقدير عمر عينة الحمض النووي. من خلال الخضوع لدورات متعددة من التغيرات الأولية، تمكن تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل من التضخيم الأسي لتسلسلات الحمض النووي الصغيرة للغاية. أصبح استخدامها في الفحوصات المعملية الطبية شائعا بشكل متزايد وضروريا لأغراض مثل البحث الطبي الحيوي والطب الشرعي الجنائي.

تتضمن الدورة الحرارية، وهي مكون أساسي لمعظم تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل، عمليات تعتمد على درجة الحرارة مثل ذوبان الحمض النووي وتكرار الحمض النووي بواسطة الإنزيمات. تضمن هذه العمليات التضخيم الفعال لتسلسلات الحمض النووي مع حماية التفاعلات أثناء الدورة الحرارية.

يتم استخدام بوليميراز Taq، وهو إنزيم مشتق من البكتيريا المحبة للحرارة "المستحرة المائية" ، في جميع تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل تقريبا. يتمتع بوليميراز Taq بمقاومة درجات الحرارة العالية المطلوبة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل، مما يمنع حدوث التحلل. قبل استخدام بوليميراز Taq، كان لابد من إضافة بوليميراز DNA يدويا إلى كل دورة، وهي عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة.

مكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل

يتكون تفاعل البوليميراز المتسلسل من عدة مكونات رئيسية

• قالب الحمض النووي: المادة الأولية، وهي الحمض النووي من العينة المطلوبة.
• بوليميراز الحمض النووي: يستخدم بوليميراز Taq بشكل شائع لأنه مقاوم للحرارة ويظل نشطًا في درجات الحرارة العالية دون أن يتغير طبيعته.
• الأوليجو نوكليوتيدات الأولية: تعمل هذه التسلسلات القصيرة أحادية السلسلة من الحمض النووي مع التسلسلات التكميلية لسلاسل الحمض النووي المستهدفة ذات الاتجاه والعكس كنقطة بداية لتخليق الحمض النووي.
• ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوتيد (dNTPs): هذه هي اللبنات الأساسية لتخليق الحمض النووي وتوفر الاستقرار أثناء البلمرة. إنها قواعد غير مقترنة.
• نظام العازل: يعزز وجود المغنيسيوم والبوتاسيوم في العازل تغير طبيعة الحمض النووي وإعادة تكوينه، ويحسن نشاط البوليميراز واستقراره.

أنواع تفاعل البوليميراز المتسلسل

يمكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل بصيغ مختلفة:

• تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي: تستخدم هذه التقنية مسبارا فلوريا لمراقبة تضخيم الحمض النووي في الوقت الحقيقي. ترتبط قوة الإشارة الفلورية من المسبار ارتباطا مباشرا بكمية جزيئات الحمض النووي المضخمة الموجودة.
• تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل: تهدف هذه الطريقة إلى زيادة الخصوصية والحساسية باستخدام مجموعات إضافية من البادئات. من خلال استهداف مناطق مختلفة، تقلل من الارتباط غير المحدد لشظايا الحمض النووي غير المرغوب فيها.
• تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الخطوات: من خلال هذا النهج، يمكن تضخيم تسلسلات الحمض النووي المستهدفة المتعددة في تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل واحدة. يسمح هذا بالتضخيم المتزامن لأهداف الحمض النووي المختلفة.
• تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي: تستخدم هذه الطريقة التضخيم الخطي للحمض النووي لتحديد ووصف وتحديد كمية هدف محدد داخل العينة.

مزايا تفاعل البوليميراز المتسلسل

يوفر تفاعل البوليميراز المتسلسل العديد من المزايا فهو سهل الاستخدام كما يعمل بسرعة. كما يتيح إنتاج منتج معين بملايين إلى مليارات النسخ باستخدام نهج شديد الحساسية للتسلسل والاستنساخ والتحليل. ويشترك تفاعل البوليميراز المتسلسل السريع في مزايا تفاعل البوليميراز المتسلسل، ولكنه يوفر أيضا القدرة على تحديد النتائج. ونتيجة لذلك، فإنه يجد تطبيقات في دراسة التغيرات في مستويات التعبير الجيني في الأورام والبكتيريا وحالات المرض الأخرى.

 يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل كأداة بحثية قوية وقيمة للغاية. يتم استخدامه لتحديد تسلسل الأمراض ذات الأسباب غير المعروفة، وإلقاء الضوء على الأمراض نفسها وكشف تسلسلات الفيروسات غير محددة سابقا المرتبطة بأمراض معروفة. إذا أمكن تبسيط العملية بشكل أكبر وتطوير تقنيات الكشف غير الإشعاعية الحساسة، فسوف يستمر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الاحتفاظ بمكانة حاسمة في المختبرات السريرية لسنوات قادمة.

•  إن استخدام بادئات DNA محددة يشير إلى هوية البكتيريا المستهدفة بدقة. في مجال البيولوجيا الجزيئية، برزت تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل كتقنية مهيمنة، تسهل التعرف على الجينات واكتشاف الطفرات، وبالتالي تعزيز قدرات الباحثين.
• لقد تطورت إلى طريقة لتحديد مسببات الأمراض الميكروبية مع الحد الأدنى من تمثيل العينة المطلوبة للتحقيق. حاليا، يتم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في المقام الأول لتشخيص التهاب القرنية الهربسي.
• تستغرق عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل ما يقرب من 4-8 ساعات، وهو ما يقل بنحو ثلاث ساعات عن الطرق التقليدية.
• يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد، وهو نوع محدد من تفاعل البوليميراز المتسلسل، بتضخيم أهداف DNA متعددة في وقت واحد. وقد اكتسبت اعترافا كمعيار ذهبي لتشخيص المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) نظرا لقدرتها على اكتشاف جينات مقاومة المضادات الحيوية المختلفة التي تنتجها المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين.

عيوب تفاعل البوليميراز المتسلسل

لدى تفاعل البوليميراز المتسلسل عدة قيود كبيرة. أحد العيوب الرئيسية هو الحاجة إلى المعرفة المسبقة بتسلسل الهدف لتصميم بادئات محددة للتضخيم الانتقائي. يجب أن يكون مستخدمو تفاعل البوليميراز المتسلسل على دراية بالتسلسلات الدقيقة الموجودة أعلى المنطقة المستهدفة على كل من القوالب أحادية السلسلة لضمان الارتباط الدقيق لبوليميراز الحمض النووي بالهجينات المكونة من البادئ والقالب والتضخيم الناجح لمنطقة الهدف بالكامل أثناء تخليق الحمض النووي.

مثل الإنزيمات الأخرى، يمكن أن تسبب بوليميرازات الحمض النووي أخطاء، مما يؤدي إلى حدوث طفرات في شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل المنتجة. ومن عيوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الأخرى إمكانية الحصول على نتائج إيجابية كاذبة أو غير دقيقة، حتى مع وجود كميات ضئيلة من الحمض النووي الملوث. لتقليل مخاطر التلوث، يجب إجراء تحضير الكواشف وإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل وتحليل النتائج في غرف منفصلة. يجب استخدام أجزاء صغيرة من الكواشف للاستخدام مرة واحدة، ويوصى باستخدام ماصات ذات أطراف ماصة طويلة للغاية ومكابس يمكن التخلص منها. من المهم أيضا اتباع سير عمل أحادي الاتجاه في المختبر وإزالة التلوث تماما من أي إمدادات أو كواشف قبل دخول غرفة تحضير تفاعل البوليميراز المتسلسل من الغرف الأخرى المستخدمة لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو النتائج.

إن تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل لها بعض القيود، بما في ذلك انخفاض الخصوصية مقارنة بالزراعة والتلوين، مما يزيد من احتمالية النتائج الإيجابية الكاذبة. إن تصميم البادئ المعقد والحاجة إلى مراعاة الميكروبات المحتملة المتعددة قبل القيام بإجراءات معقدة كانا يشكلان تحديا للأطباء.

التحديات والإمكانات التي يوفرها الترميز الشريطي الميتابوليزمي القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل في أخذ العينات البيئية

• تلعب تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل دورا حاسما في تحقيقات الترميز الشريطي الميتابوليزمي، ولكن النتائج تختلف بشكل كبير عن طرق أخذ العينات التقليدية غير القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل. ويؤدي هذا إلى عدة ملاحظات مهمة.
• أولا، لا توجد علاقة مباشرة أو تطابق فردي بين عدد القراءات المعينة في دراسة الحمض النووي البيئي ووفرة الكائن الحي المصدر.
•  ثانيا، لا يمكننا أن نتوقع باستمرار وجود ارتباط كبير في تقديرات ثراء التصنيفات بين الحمض النووي البيئي والطرق التقليدية. حتى التعديلات الصغيرة في الإجراءات المعملية يمكن أن تؤدي إلى تناقضات كبيرة في النتائج.
• على الرغم من هذه التحديات، فقد أثبتت مسوحات الترميز الشريطي الميتابوليزمي أنها مفيدة للغاية. فهي تمكن من اكتشاف مئات أو آلاف التصنيفات في كل عينة وتسهل تحديد المجتمعات البيولوجية في مواطن مختلفة ومواقع أخذ العينات. ومع ذلك، لكي يصبح الحمض النووي البيئي مصدًا مشتركا للبيانات في أخذ العينات البيئية، فمن المهم فهم الآليات التي تربط قراءات الكتلة الحيوية أو الأعداد الخاصة ب. إن هذا الفهم ضروري لتطبيقات مثل تقييم مخزونات مصايد الأسماك أو مسوحات السكان للأنواع المهددة بالانقراض، والتي تتطلب تحديد كميات الكائنات الحية.

من خلال التركيز على توليد بيانات الترميز الشريطي، اكتسبنا رؤى حول الطرق المحددة التي يمكن بها مقارنة هذه البيانات بطرق المسح الأخرى أو لا يمكن مقارنتها بها. وبذلك، قدمنا ​​آلية قابلة للقياس لمراقبة التغيرات في العينات البيئية.