ما هي خطوات تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

تستخدم تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم الحمض النووي أو الجينات المستهدفة من خلال جولات متعددة من التضاعف. وتتضمن عملية تفاعل البوليميراز المتسلسلة ثلاث خطوات رئيسية: التحلل، التلدين ، وتمديد البادئات. وتتضمن خطوة التحلل فصل جزيء الحمض النووي ثنائي السلسلة إلى سلسلتين مفردتين. والخطوة التالية هي التلدين ، والتي تتضمن ربط تسلسلات قصيرة من الحمض النووي تسمى البادئات بكل من السلسلتين المفردتين من الحمض النووي المستهدف.

ما هو تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل تقنية قوية تستخدم على نطاق واسع في علم الأحياء الجزيئي والمجالات ذات الصلة لتضخيم أجزاء معينة من الحمض النووي الجينومي أو الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي البلازميدي. يشير الحمض النووي الجينومي إلى الحمض النووي الكروموسومي الموجود في الكائنات الحية، في حين أن البلازميدات هي أجزاء دائرية من الحمض النووي موجودة في البكتيريا والتي توجد بشكل مستقل عن الحمض النووي الكروموسومي. تتضمن غالبية طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل إخضاع مكونات التفاعل لدورة حرارية، والتي تستخدم دورات متكررة من التسخين والتبريد في درجات حرارة مختلفة لتوليد عدد كبير من نسخ الحمض النووي.

تعرف أيضا بأنها تقنية تعمل على تضخيم الحمض النووي حيث تعتمد على سلسلة من دورات درجة الحرارة الحاسمة لتضخيم الحمض النووي المستهدف. تشمل عملية الدورة ثلاث مراحل رئيسية: التحلل، والتلدين، والتمديد. تتكرر هذه المراحل لمدة 30-40 دورة، مما يؤدي إلى مضاعفة كمية الحمض النووي المستهدف. تمثل عملية دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل هذه نهجا عالي الكفاءة لتضخيم تسلسلات الحمض النووي المحددة، مما يجعلها أداة لا غنى عنها في علم الأحياء الجزيئي والبحث الجيني.

تفاعل البوليميراز المتسلسل هو تفاعل في المختبر يستخدم لتضخيم الجينات المرغوبة أو شظايا الحمض النووي. تستخدم هذه التقنية مادة أولية وتستخدم على نطاق واسع في المختبرات لتوليد مليارات النسخ من الجين المرغوب لأغراض البحث والتشخيص والعلاج. اخترع كاري موليس تفاعل البوليميراز المتسلسل في عام 1983. لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل، يلزم وجود مادة أولية للحمض النووي مصممة لقالب الحمض النووي وبوليميراز الحمض النووي المستقر حراريا. من خلال دورات متكررة من التفاعل، يمكن الحصول على مليارات النسخ من الحمض النووي المستهدف. يلعب تفاعل البوليميراز المتسلسل دورا محوريا في التكنولوجيا الحيوية وعلم الأحياء الطبية والتشخيص والتحليل الجنائي وأبحاث علم الأحياء الجزيئي، من بين مجالات أخرى. يمكن تسلسل الحمض النووي المضخم واستنساخه وتصوره من خلال الرحلان الكهربائي للهلام.

المراحل الرئيسية لعملية دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل:

 1- التحلل

التحلل هو الخطوة الأولى في تفاعل البوليميراز المتسلسل، وهو أمر بالغ الأهمية لفصل عينة الحمض النووي ثنائي السلسلة. ويتضمن تسخين خليط التفاعل إلى 94-98 درجة مئوية لمدة 20-30 ثانية أو 0.5 إلى 2 دقيقة لكسر الروابط الهيدروجينية بين خيوط الحمض النووي. وتؤدي هذه العملية إلى تكوين خيوط مفردة من الحمض النووي. وتضمن مدة أطول من درجات الحرارة المرتفعة الفصل الكامل للخيطين. ثم تعمل هذه الخيوط المفردة كقوالب لتخليق خيوط الحمض النووي الجديدة.

2- التلدين

أثناء خطوة التلدين في تفاعل البوليميراز المتسلسل، يتم خفض درجة حرارة التفاعل إلى 54-60 درجة مئوية لمدة 20-40 ثانية تقريبا. وعند هذه الدرجة من الحرارة ترتبط البادئات، وهي تسلسلات أحادية السلسلة من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي يبلغ طولها حوالي 20 إلى 30 قاعدة، بتسلسلاتها التكميلية على قالب الحمض النووي. تتحرك خيوط DNA القالبية في اتجاهين متعاكسين، مما يؤدي إلى وجود بادئين: بادئ أمامي وبادئ عكسي.

تتطلب عملية التلدين الحفاظ على درجة حرارة مناسبة لضمان تهجين البادئ الدقيق مع المناطق التكميلية لقالب DNA أحادي السلسلة. بمجرد إقران البادئ وخيوط القالب بشكل صحيح، يرتبط بوليميراز DNA بالهجين القالب-البادئ ويبدأ تخليق DNA.

تتضمن هذه الخطوة الحاسمة خفض درجة الحرارة إلى حوالي 50-56 درجة مئوية أو 36 درجة مئوية للتضخيم المحدد. عند هذه درجات الحرارة، ترتبط البادئات بقوالب DNA أحادية السلسلة، مما يوفر نقطة بداية لإنزيم البوليميراز لبدء تخليق خيوط DNA جديدة.

3- التمديد

أثناء خطوة التمديد في تفاعل البوليميراز المتسلسل، يتم استخدام بوليميراز DNA ثابت الحرارة، وعادة ما يكون بوليميراز. تحدث هذه الخطوة عند درجة حرارة 75-80 درجة مئوية (72 درجة مئوية). تعمل بوليميراز الحمض النووي عن طريق إضافة النيوكليوتيدات في الاتجاه 5'-3'، وبالتالي تصنيع الشريط التكميلي لقالب الحمض النووي.

لبدء التمديد، يتم رفع درجة الحرارة إلى حوالي 72-75 درجة مئوية لمدة 15-30 ثانية. عند هذه الدرجة المرتفعة من الحرارة، يقوم إنزيم البوليميراز بتمديد البادئات عن طريق دمج النيوكليوتيدات إلى الطرف 3' لقالب الحمض النووي. تؤدي هذه العملية إلى إنشاء جزيء DNA مزدوج السلسلة جديد.

لضمان الأداء الأمثل لبوليميراز Taq، يتم تسخين التفاعل بعد ذلك إلى 72 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق. تسمح هذه الدرجة للبوليميراز بالالتصاق بالبادئ وبدء إضافة النيوكليوتيدات واحدًا تلو الآخر في الاتجاه 5'-3'، مما يسهل بناء خيوط الحمض النووي التكميلية.

تتضمن عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل تكرار الدورة 25-30 مرة لتضخيم عينة الحمض النووي بمليار مرة. لتصوير نتائج هذه العملية، يتم استخدام التحليل الكهربائي للهلام.

أهمية البادئات لتفاعل البوليميراز المتسلسل

 هي شظايا قصيرة من الحمض النووي تعمل كدلالات لبدء تكرار الحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل. البادئات ضرورية لنجاح التفاعل، لأنها توفر نقاط البداية اللازمة لتخليق الحمض النووي من خلال الارتباط بتسلسلات الهدف التكميلية. من خلال استهداف مناطق معينة من الاهتمام بشكل انتقائي، تسمح البادئات للباحثين بتضخيم ودراسة أجزاء معينة من الحمض النووي، مما يسهل مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك تحليل التعبير الجيني، وتسلسل الحمض النووي، وتشخيص المرض. بدون البادئات، ستكون عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل غير مكتملة، مما يؤكد دورها الذي لا غنى عنه في إطلاق العنان لإمكانات هذه التقنية التحويلية.

تحديد عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل

يعد تحديد العدد المناسب لدورات تفاعل البوليميراز المتسلسل خطوة حاسمة في عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل. يعتمد عدد الدورات المطلوبة على عوامل مختلفة، بما في ذلك الكمية الأولية من الحمض النووي المستهدف، وحساسية طريقة الكشف، ومستوى التضخيم المطلوب. الهدف من تفاعل البوليميراز المتسلسل هو تضخيم الحمض النووي المستهدف إلى مستوى يمكن اكتشافه أو تحليله. ومع ذلك، من المهم تجنب التضخيم المفرط، لأنه قد يؤدي إلى تضخيم غير محدد أو تكوين منتجات ثانوية غير مرغوب فيها، مما يعرض جودة منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل للخطر. وبالتالي، يوصى بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل بأقل عدد من الدورات اللازمة لتحقيق المستوى المطلوب من التضخيم.

يجب مراعاة العديد من العوامل، مثل طول الحمض النووي المستهدف، وكفاءة البادئ، ونوع بوليميراز الحمض النووي، وظروف دورة الترموس، لتحديد العدد الأمثل للدورات. عادةً، تكون 20-30 دورة كافية لمعظم تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل، ولكن العدد الأمثل قد يختلف اعتمادًا على المتطلبات المحددة. يمكن أن تساعد التجربة التجريبية التي تتضمن مجموعة من أرقام الدورات، تليها تحليل منتجات التضخيم الناتجة على هلام الأجار، في تحديد رقم الدورة الأمثل الذي يوفر تضخيمًا مناسبًا بدون منتجات غير محددة. من المهم تقليل عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمة للحفاظ على دقة منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل، حيث أن العدد الأكبر من الدورات قد يزيد من احتمالية حدوث أخطاء أو طفرات.