ما هو التلطيخ المناعي أو التلطيخ الغربي؟

التلطيخ الغربي، المعروف أيضا باسم التلطيخ المناعي، هو تقنية تستخدم لتحليل البروتينات الفردية في خليط بروتيني، مثل محاليل الخلايا. في التلطيخ الغربي (التلطيخ المناعي)، يتم تطبيق خليط البروتين على الرحلان الكهربائي للهلام في مصفوفة حاملة (SDS-PAGE، PAGE الأصلي، التركيز الكهربائي المتساوي، الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد، إلخ) لفصل البروتينات بناء على الحجم أو الشحنة أو الاختلافات الأخرى في نطاقات البروتين الفردية. يتم نقل نطاقات البروتين المنفصلة بعد ذلك إلى غشاء حامل، مثل نتروسليلوز أو نايلون أو PVDF، وهي العملية التي يشار إليها باسم التلطيخ. تلتصق البروتينات بالغشاء وفقا لنفس النمط الذي يتبعه فصلها بسبب تفاعلات الشحنة. ثم تصبح البروتينات الموجودة على التلطيخ المناعي متاحة للارتباط بالأجسام المضادة للكشف عنها.

التلطيخ الغربي، هو تقنية بحثية مستخدمة على نطاق واسع تمكن من فصل وتحديد البروتينات المحددة داخل خليط معقد. يسمح هذا بتحديد مستويات البروتين النسبية بين العينات وتحديد الوزن الجزيئي للهدف، مما يوفر رؤى حول معالجته بعد الترجمة. لتحقيق ذلك، يستخدم ويسترن بلوت ثلاث خطوات: (1) فصل البروتينات بناء على الحجم، (2) نقلها إلى دعامة صلبة، و(3) تصور البروتين المستهدف باستخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية.

على الرغم من بساطته الإجمالية، فإن ويسترن بلوت هي تقنية قوية بشكل لا يصدق لأنها توفر معلومات إضافية لا يمكن الحصول عليها بسهولة من تقنيات المختبر المناعية الأساسية الأخرى فمن خلال فصل البروتينات حسب الحجم أثناء الرحلان الكهربائي للهلام ثم اكتشافها لاحقا باستخدام جسم مضاد مستهدف بشكل خاص، يؤكد الإجراء بشكل أساسي هوية البروتين المستهدف.

تتضمن عملية ويسترن بلوت عدة خطوات مهمة لإكمالها بنجاح

تتضمن ويسترن بلوت ست خطوات، والتي تشمل تحضير العينة، والرحلان الكهربائي للهلام، ونقل البروتين، والحجب، وحضانة الأجسام المضادة، واكتشاف البروتين وتصوره.

1. لإعداد العينة، يتم استخراج البروتينات من مصادر مختلفة مثل الأنسجة أو الخلايا حيث يتم تفكيك عينات الأنسجة باستخدام طرق ميكانيكية مثل التجانس أو الموجات فوق الصوتية. تتم إضافة مثبطات البروتياز والفوسفاتيز لمنع هضم العينة في درجات الحرارة المنخفضة. يتم تحديد تركيز البروتين باستخدام مطياف ضوئي لتحميل العدد المناسب من البروتينات في كل بئر.

2. يتم إجراء الرحلان الكهربائي للهلام باستخدام هلام بولي أكريلاميد (PAG) محمل بكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). يتم استخدام نوعين من هلام الأجار: هلام التكديس، الذي يركز جميع البروتينات في نطاق واحد، وهلام الفصل، الذي يفصل البروتينات بناء على الوزن الجزيئي, تهاجر البروتينات الأصغر بشكل أسرع في SDS-PAGE تحت الجهد المطبق. يحدد حجم مسام الهلام نطاق فصل البروتين، والذي يتراوح عادة من 5 إلى 2000 كيلو دالتون.

3. يتضمن نقل البروتين نقل البروتينات المنفصلة من الهلام إلى غشاء دعم صلب، مما يجعلها في متناول الكشف عن الأجسام المضادة.كما يعد النقل الكهربائي هو الطريقة الرئيسية المستخدمة، حيث يتم تطبيق مجال كهربائي عمودي على سطح الهلام لسحب البروتينات إلى الغشاء. يمكن القيام بذلك في ظروف شبه جافة أو رطبة، حيث تكون الظروف الرطبة أكثر موثوقية.

4. يعد الحجب خطوة أساسية لمنع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة بالغشاء كما يتم استخدام حاصرات شائعة مثل BSA والحليب المجفف منزوع الدسم. يتم وضع الغشاء في محلول بروتين مخفف، مما يسمح للبروتينات بالارتباط بالمناطق غير المستهدفة على الغشاء وتقليل الضوضاء الخلفية في نتائج اللطخة النهائية.

5. تتضمن حضانة الأجسام المضادة ارتباط الأجسام المضادة الأولية بالبروتين المستهدف. يعتمد اختيار الجسم المضاد الأولي على المستضد المحدد الذي سيتم اكتشافه كما يساعد غسل الغشاء بمحلول عازل للأجسام المضادة على تقليل الخلفية وإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة. ثم يتعرض الغشاء لجسم مضاد ثانوي محدد مرتبط بالإنزيم، والذي يرتبط بالجسم المضاد الأولي الذي تفاعل مع البروتينات المستهدفة. يتم اختيار الجسم المضاد الثانوي المناسب بناءً على نوع الجسم المضاد الأولي المستخدم.

6. يتم تحقيق اكتشاف البروتين وتصوره باستخدام ركيزة تتفاعل مع الإنزيم المرتبط بالجسم المضاد الثانوي، مما يؤدي إلى توليد مادة ملونة. يتيح هذا تحديد كثافة البروتين المستهدف وموقعه. تتم مقارنة أشرطة البروتين بعلامة لتقريب الحجم. تتوفر أنظمة كشف مختلفة، بما في ذلك الطرق اللونية والكيميائية الضوئية والإشعاعية والفلورية.

كيف تختار الأجسام المضادة المناسبة؟

يعتمد اختيار الأجسام المضادة لتحليل لطخة ويسترن على جودة الأجسام المضادة والظروف التجريبية التي تستخدم فيها. لتحقيق حساسية وخصوصية عالية، من المهم مراعاة العوامل التالية.

عند العمل مع عينات تحتوي على غلوبولينات مناعية داخلية، مثل محاليل الأنسجة أو مستحلبات زراعة الأنسجة التي تحتوي على مصل، يوصى باختيار جسم مضاد أولي تم تربيته في نوع مختلف عن نوع العينة. على سبيل المثال، إذا كنت تدرس بروتين فأر، فاختر جسما مضادا أوليا تم تربيته في نوع آخر غير الفأر، مثل الأرنب. يساعد هذا في منع التفاعل المتبادل بين الجسم المضاد الثانوي المضاد للغلوبولين والغلوبولينات المناعية الداخلية الموجودة في العينة. ومع ذلك، عند العمل مع عينات لا تحتوي على غلوبولينات مناعية داخلية، يكون اختيار النوع المضيف للجسم المضاد الأولي أقل أهمية.

كلما أمكن، ينصح باختيار جسم مضاد أولي تم التحقق من صحته عن طريق إزالة الجين حيث يضمن هذا التحقق أن الجسم المضاد يرتبط بشكل خاص بالهدف المقصود.

لتصور البروتين الذي يهمك، اختر جسما مضادا ثانويا يرتبط بالنوع المضيف للجسم المضاد الأولي. توفر الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالإنزيم، مثل الأجسام المضادة المرتبطة(HRP) أو الفوسفاتيز القلوي (AP)، أو مركبات الفلورسنت المحسنة بتقنية ويسترن بلوت ذات مستوى عاليا من الحساسية. من المهم التأكد من أن طول موجة انبعاث الضوء من المركب متوافق مع جهاز القراءة أو الماسح الضوئي الخاص بك.

يعد استخدام الأجسام المضادة الثانوية في تقنية ويسترن بلوت مفيدًا بسبب حساسيتها المتزايدة مقارنة باستخدام الأجسام المضادة الأولية فقط. ترتبط الأجسام المضادة الثانوية بمواقع متعددة على الجسم المضاد الأولي، وبالتالي تضخيم الإشارة. يسهل تضخيم الإشارة هذا اكتشاف البروتين المطلوب في خليط بروتيني معقد.

في بعض الحالات، يمكن أن يؤدي استخدام الأجسام المضادة الأولية المرتبطة مباشرة، مثل مركبات بيروكسيديز الفجل (HRP)، إلى تسريع وتبسيط بروتوكول ويسترن بلوت من خلال القضاء على الحاجة إلى خطوة الأجسام المضادة الثانوية. عند اختيار مركبات الأجسام المضادة الأولية، من الأهمية بمكان ضمان خصوصية الأجسام المضادة. تفضل الأجسام المضادة الأحادية النسيلة المعاد تركيبها لأنها توفر خصوصية عالية وأداء ثابتا عبر دفعات مختلفة.

ومع ذلك، من المهم ملاحظة أنه على عكس الأجسام المضادة الثانوية، لا توفر المركبات الأولية تضخيما كافيا. لذلك، يجب أن يكون البروتين المستهدف وفيرا في العينة للكشف الفعال. تقدم Abcam مجموعة واسعة من الأجسام المضادة الأولية المعاد تركيبها المعاد تركيبها المقترنة مباشرة بـ HRP، وهي مناسبة لتحليل النقل الغربي. إذا لم يكن الجسم المضاد المطلوب متاحا في تنسيق مقترن مناسب، فيمكنك الاستفادة من مجموعات النقل الغربي للأجسام المضادة من Abcam.

تطبيقات اللطخة الغربية

هنالك  استخدامات مختلفة في مجالات علمية مختلفة. والغرض الأساسي منها هو تقييم وجود أو غياب وحجم ووفرة البروتينات المستهدفة في العينة. هذه المعلومات قيمة لأسباب علمية متعددة. فيما يلي بعض التطبيقات المحددة لتقنية النقل الغربي:

1. تفاعلات البروتين مع الحمض النووي: يمكن استخدام النقل الغربي لدراسة التفاعلات بين البروتينات وجزيئات الحمض النووي. يساعد هذا في فهم العمليات البيولوجية المهمة مثل تنظيم الجينات وإصلاح الحمض النووي.

2. تفاعلات البروتين مع البروتين: هذه التقنية مفيدة في التحقيق في التفاعلات بين البروتينات المختلفة داخل سياق خلوي. وهذا يساعد في توضيح المجمعات البروتينية ومسارات الإشارة ووظائف البروتين.

3. التعديلات بعد الترجمة (PTMs): يسمح النقل الغربي بالكشف عن التعديلات بعد الترجمة وتحليلها، وهي تعديلات كيميائية تحدث بعد تخليق البروتين. تشمل أمثلة التعديلات بعد الترجمة الفسفرة والأستلة والجليكوزيل. يوفر تقييم هذه التعديلات رؤى حول نشاط البروتين وتنظيمه.

4. اكتشاف الأشكال المتماثلة للبروتين: الأشكال المتماثلة هي إصدارات أو متغيرات مختلفة من البروتين تنشأ من الوصل البديل أو آليات أخرى. يمكن للنقل الغربي التمييز بين الأشكال المتماثلة المحددة وتحديد كميتها، مما يتيح دراسة الاختلافات الوظيفية وتأثيراتها في المرض.

5. توصيف الأجسام المضادة: النقل الغربي مفيد لتقييم خصوصية وحساسية الأجسام المضادة. يمكن أن يؤكد ارتباطها بالهدف المقصود ويثبت ملاءمتها للاستخدام في إجراءات تجريبية مختلفة.

6. رسم خرائط النمط: النمط هو مناطق محددة على المستضد تتعرف عليها الأجسام المضادة وترتبط بها. يمكن استخدام النقل الغربي لتحديد هذه النمط ورسم خرائط لها، مما يساعد في تطوير الأجسام المضادة وفهم تفاعلات المستضد والأجسام المضادة.

7. تحديد موقع البروتين تحت الخلوي: باستخدام أجسام مضادة محددة، يمكن للنقل الغربي تحديد موقع البروتينات تحت الخلوي. تساعد هذه المعلومات في فهم توزيع البروتين داخل الخلايا وأدواره في المقصورات الخلوية المختلفة.

هذه بعض التطبيقات الشائعة لتقنية اللطخة الغربية لتنوعها وقدرتها على توفير معلومات حول وجود البروتين وتفاعلاته وتعديلاته وموقعه.