رفع اشکالات الکتروفورز عمودی
در این مقاله اشکالات الکتروفورز عمودی که به طور معمول پیش می آید به همراه دلیل مشکل و روش حل آن ارایه شده است.
اشکال: عدم پلیمریزاسیون یا پلیمریزاسیون ناقص
علت: پایین بودن دمای محلولها
راهکار : قبل از استفاده لازم است دمای محلول به دمای محیط برسد (30 -20 سانتیگراد).
علت: کهنگی یا کم بودن مقدار کاتالیزورها مخصوصا آمونیوم پرسولفات
راهکار : محلول تازه آمونیوم پر سولفات تهیه شود. مقدار بیشتری به ژل اضافه شود.
علت: کهنه بودن استوک اکریل آمید
راهکار : محلول تازه اکریل آمید تهیه گردد.
علت: غلظت بالای ماده احیا کننده 2- مرکاپتواتانل
راهکار : در صورت امکان 2- مرکاپتواتانل را در غلظت کم به ژل اضافه کنید. یا آن را در محلول ژل وارد نکنید.
علت: اثر اکسیژن هوا بخصوص در محلولهای سرد
راهکار: دمای محلول ها به دمای محیط برسد.محلول ژل هواگیری شود.
اشکال: منعقد نشدن بخشی از ژل اکریل آمید در قالب شیشهای
علت: مخلوط نشدن آمونیوم پرسولفات در محلول ژل مخصوصا در ژلهای غلیظ
راهکار: بعد از افزودن آمونیوم پرسولفات به محلول آن را کاملا مخلوط کنید.
اشکال: جدا شدن ژل از شیشه
علت: کثیف بودن سطح شیشه
راهکار: سطح شیشه را کاملا تمیز کنید.
مشکل: چروکیده شدن ژل
علت: گرمای زیاد در هنگام الکتروفورز به دلیل مقاومت الکتریکی
راهکار: سیستم با گردش آب خنک گردد یا الکتروفورز در جریان الکتریکی کمتر و در مدت طولانی تر صورت گیرد.
علت: بالا بودن ضخامت یا درصد ژل در هنگام خشک کردن یا قطع جریان برق در هنگام خشک شدن ژل در دستگاه خشک کن
راهکار: قبل از خشک کردن ژل را نیم ساعت در محلول حاوی متانول 30 – 20 درصد و گلیسرول 3 درصد قرار دهید.
مشکل: چاهک های نامنظم و ناقص در ژل بالا (ژل متراکم کننده)
علت: محبوس شدن انتها یا کناره های دندانه شانه
راهکار: شانه را خارج ساخته و مجددا در در محل خود قرار دهید به نحوی که حباب هوا نداشته باشد.
علت: خارج ساختن شانه قبل از کامل شدن انعقاد ژل بالا
راهکار: پس از اطمینان از انعقاد ژل بالا اقدام به خارج کردن شانه کنید.چاهک ها را با بافر الکترود بشویید.
مشکل: قرار نگرفتن نمونه در ته چاهکچاهک ها را با بافر الکترود بشویید.
علت: عدم وجود گلیسرول یا ساکارز در بافر نمونه
راهکار: به بافر نمونه گلیسرول یا ساکارز اضافه کنید.
مشکل: جاری شدن نمونه در چاهک های کناری
علت: بزرگ تر بودن ضخامت spacerها نسبت به ضخامت شانه
راهکار: در هنگام تهیه ژل از شانه مناسب استفاده شود.
علت: سر ریز شدن چاهک ها از نمونه
راهکار: حدود یک دوم تا یک سوم چاهک را از نمونه پروتئین بریزید.
مشکل: وجود باند قوی در ابتدای ژل جدا کننده
علت: وجود تجمعات بزرگ و نامحلول پروتئین یا لیپوپروتئین در نمونه (مخصوصا در PAGE)
راهکار: نمونه را قبل از الکتروفورز نمونه را min 15 در g 20000 سانتریفیوژ نمایید. الکتروفورز را در حضور مواد تسهیل کننده حلالیت پروتئین ها انجام دهید.
علت: وجود ژل متراکم کننده (معمولا در PAGE)
راهکار: در سیستم بافری پیوسته الکتروفورز را انجام دهید.
علت: بالا بودن درصد ژل نسبت به وزن مولکولی عده ای از پروتئین های موجود در نمونه
راهکار: در صورت امکان درصد ژل را پایین آورید. یا الکتروفورز را در ژل با شیب غلظت انجام دهید.
علت: کاهش غلظت SDS یا ماده احیا کننده (در SDS-PAGE)
راهکار: غلظت SDS یا ماده احیا کننده را در بافر نمونه افزایش دهید.یا در صورت امکان نمونه پروتئین را رقیق کنید تا نسبت غلظت آن با SDS و ماده احیا کننده متناسب گردد.
علت: پایین بودن pH نمونه (بخصوص بعد از رسوب با تری کلرو استیک اسید)
راهکار: pH نمونه را تنظیم کرده یا در مقابل بافر مناسب دیالیز کنید.قبل از الکتروفورز نمونه را min 15 در g 20000 سانتریفیوژ نمایید.
مشکل: باندهای نامنظم و مواج
علت: وجود حباب هوا در ژل
راهکار: محلول ژل را هواگیری نمایید.
علت: ناهمگونی اندازه منافذ ژل
راهکار: محلول ژل را کاملا مخلوط نمایید، مقدار آمونیوم پرسولفات را تنظیم نمایید تا زمان انعقاد ژل متناسب گردد.
علت: لرزش قالب شیشه ای در هنگام انعقاد ژل
راهکار: قالب ژل را کنار دستگاه های لرزاننده قرار ندهید.
علت: ادامه پلیمریزاسیون ژل در چاهک ها پس از خارج ساختن شانه
راهکار: پس از انعقاد کامل ژل بالا و خارج نمودن شانه، چاهک ها را با بافر الکترود شستشو دهید.
علت: بالا بودن غلظت نمک در نمونه
راهکار: نمونه را با بافر نمونه (1X) رقیق کرده یا در مقابل بافر مناسب دیالیز نمایید.
مشکل: وجود ستون های رنگی با باندهای نامشخص یا کاملا تفکیک نشده
علت: وجود غلظت بالای موادی همچون کلرید گوانیدیوم در نمونه
راهکار: در صورت امکان نمونه را رقیق کنید.کلرید گوانیدیوم را با ترکیبات سازگار همچون اوره تعویض کنید.
مشکل: خطوط رنگی در مسیر الکتروفورز در ستون ها
علت: حل شدن تدریجی توده های مولکولی موجود در نمونه
راهکار: قبل از الکتروفورز نمونه را min 15 در g 20000 سانتریفیوژ نمایید.
مشکل: وجود باندهای کاذب در تمام ستون ها یا در سراسر عرض ژل
علت: اثر بتامرکاپتواتانول پس از رنگ آمیزی ژل با نقره آمونیاکی (به صورت دو باند منتشره در موقعیت های 50 و 67 کیلودالتون)
راهکار: بجای بتا مرکاپتو اتانول از DTT استفاده نمایید.یا ژل را به روش دیگری رنگ آمیزی کنید.
علت: آلوده شدن بافر نمونه
راهکار: بافر نمونه تازه تهیه کنید.
علت: وجود ناخالصی در بافر مخزن بالا (در الکتروفورز عمودی)
راهکار: از مواد شیمیایی با خلوص و کیفیت بالا برای تهیه بافرها استفاده کنید. ترجیحا از بافرها مجددا استفاده نکنید.
مشکل: عدم تکرار پذیری نتایج الکتروفورز
علت: پروتئولیز نمونه در هنگام استخراج یا نگهداری آن
راهکار: استخراج نمونه در دمای پایین و در حضور مهارکننده های پروتئاز صورت گیرد.نمونه در شرایطی نگهداری شود که دچار حداقل تغییرات گردد.
علت: متناسب نبودن مقدار SDS و یا ماده احیا کننده در بافر نمونه نسبت به پروتئین (در SDS-PAGE)
راهکار: غلظت SDS یا ماده احیا کننده را در بافر نمونه افزایش دهید.یا در صورت امکان نمونه پروتئین را رقیق کنید تا نسبت غلظت آن با SDS و ماده احیا کننده متناسب گردد.
علت: تغییر در روش یا شرایط رنگ آمیزی
راهکار: ژل ها را با یک روش ثابت رنگ آمیزی کنید.
مشکل: تبلور اوره در ژل
علت: پایین بودن درجه حرارت
راهکار: الکتروفورز در دمای 15 درجه سانتی گراد انجام شود.
مشکل: ضعیف بودن باندها
علت: سرعت زیاد الکتروفورز
راهکار: ولتاژ کاهش داده شود.یا بافر بیش از حد رقیق است. غلظت بافر افزایش داده شود.
علت: حل نشدن باندهای پروتئین
راهکار: زمان الکتروفورز طولانی تر شود.یا اندازه منافذ ژل برای پروتئین هایی که باید جدا شوند صحیح نیست. از ژل با درصد اکریل آمید متفاوت استفاده شود.
علت: حجم نمونه بیش از حد زیاد است.
راهکار: غلظت پروتئین را افزایش دهید.
علت: ژل بیش از حد کهنه است.
راهکار: از ژل های تازه استفاده کنید.
مشکل: اسمیر (smear) شدن باندها
علت: ولتاژ استفاده شده بسیار زیاد است.
راهکار: ولتاژ را کاهش دهید.
علت: غلظت پروتئین بیش از حد زیاد است.
راهکار: مقدار پروتئین load شده در ژل را کاهش دهید.
علت: غلظت نمک بیش از حد زیاد است.
راهکار: نمونه ها را دیالیز کنید.
علت: بافر تانک کهنه است.
راهکار: بافر تانک تازه استفاده کنید.
علت: زمان رنگ بری کوتاه است.
راهکار: مدت زمان رنگ بری را افزایش دهید.
