اصول اولیه طراحی پرایمر

پرایمر چیست؟

در طراحی پرایمر هیچ DNA پلی­مرازی قادر به ساختن DNA نیست و همه DNA پلی­مرازها به یک انتهای OH ‘3 نیاز دارند تا بتوانند تکثیر را از روی DNA الگو انجام دهند. به همین دلیل برای تکثیر DNA چه در درون سلول و چه در محیط in vitro نیاز به پرایمر (primer است. در واقع پرایمر توالی کوتاهی از جنس DNA است که با ایجاد یک انتهای OH ‘3 جایگاهی برای فعالیت آنزیم DNA پلی­مراز ایجاد می­کند تا بتواند از رشته الگو سنتز را ادامه دهد. برای تکثیر یک قطعه نیاز به دو پرایمر است که Forward و Reverse نام دارند و با حروف اختصاری F و R نشان داده می‌شوند. اتصال پرایمرها به مولکول الگو بر پایه پیوندهای هیدروژنی استوار است. DNA دو رشته­ایی است و ژن روی یکی از دو رشته قرار دارد. رشته ­ایی که توالی ژن روی آن قرار دارد رشته sense و رشته مقابل آن anti-sense نامیده می­شود. پرایمر Forward برای رشته sense طراحی می­شود. در مقابل، برای سنتز رشته Anti-sense پرایمر Reverse طراحی می­شود. در واقع جهت انجام فرایند تکثیر DNA در دستگاه ترموسایکلر لازم است طراحی پرایمر به خوبی صورت گرفته باشد.

نرم افزارهای طراحی پرایمر و آموزش تصویری طراحی پرایمر

اهداف طراحی پرایمر

1- محدود کردن تکثیر: برای اینکه یک قطعه خاصی از ژنوم را تکثیر کنیم با توجه به توالی DNA الگو پرایمر طراحی کرده و محل دقیق تکثیر را مشخص می­کنیم. مثلا زمانی که هدف تکثیر یک ژن خاص است باید ابتدا و انتهای ژن را بدانیم و از قسمت ابتدا و انتهای ژن طراحی پرایمر انجام شود تا بتوان با استفاده از PCR این ژن را تکثیر کرد و آن را در موجود دیگری کلون کرد.

2- گاهی هدف اثبات وجود یا عدم وجود یک ژن در ارگانیسم است. برای این هدف نیازی نیست که حتما از ابتدا و انتهای ژن طراحی پرایمر انجام شود. می­توان از قسمت­های مختلف ژن پرایمری با کارایی و اختصاصیت بالا طراحی کرد که بسته به طول ژن می­توان از وسط یا قسمت­های دیگر ژن طراحی را انجام داد. ولی در مورد قبل که در بالا ذکر گردید حتما باید از ابتدا و انتهای ژن طراحی انجام شود.

3- پرایمرها برای نقشه یابی ژنوم نیز کاربرد دارند. برای نقشه یابی ژنوم از پرایمرهای تصادفی استفاده می ­شود.

ویژگی های پرایمر

پرایمرهای طراحی شده باید دو ویژگی اصلی و مهم را دارا باشند. کارایی پرایمر یا Efficiency پرایمر یک ویژگی است که نشان می­ده یک پرایمر تا چه حد در اتصال به ناحیه هدف و تکثیر قطعه مورد نظر و ایجاد محصول نهایی موفق بوده است. هر چه کارایی پرایمر بالاتر باشد، باند قوی­تری در ژل الکتروفورز مشاهده خواهد شد.

ویژگی دوم اختصاصیت یا Specificity است که به این معنی است که پرایمر تنها به توالی مورد نظر متصل می­شود و نه هیچ جای دیگری از DNA الگو. بنابراین برای پرایمرهای با اختصاصیت بالا، در الکتروفورز تنها یک باند مشاهده می­شود. برای حفظ این دو ویژگی در طراحی پرایمر باید نکاتی را در حین طراحی رعایت کرد این نکات شامل: طول پرایمر ، محتوای GC، GC Clamp، دمای Tm، دمای اتصال پرایمر به رشته الگو و طول قطعه تکثیری است که در ادامه توضیح داده خواهند شد.

مهمترین موارد در طراحی پرایمر

1- طول پرایمر

به منظور تکثیر توالی DNA مد نظر محقق در  دستگاه ترموسایکلر (دستگاه PCR) لازم است که طول بهینه ای از پرایمر طراحی گردد. طول پرا یمر فاکتوری است که بر اختصاصی بودن پرایمر تاثیر زیادی دارد. بطور کلی DNA از 4 نوع باز تشکیل شده است که طبق قانون احتمالات، احتمال حضور هر کدام از این نوکلئوتیدها برابر یک چهارم است. اگر توالی پرایمر مورد نظر از 10 نوکلئوتید تشکیل شده باشد احتمال وجود چنین توالی روی DNA الگو برابر با یک چهارم به توان 10 است. این بدین معناست که از هر یک میلیون باز، یک توالی مشابه توالی 10تایی پرایمر ما وجود دارد. ژنوم E. Coli حدود 6/4 میلیارد باز تشکیل شده است، پس احتمال وجود پرایمر 10 جفت بازی ما در این ژنوم برابر 6/4 است. به عبارت دیگر 6/4 بار احتمال دارد که پرایمر ما روی ژنوم تکرار شود. اگر طول پرایمر 20 نوکلئوتید شود این پرایمر از هر 50 میلیارد باز می­تواند جایگاه خود را پیدا کند. در نتیجه با افزایش طول پرایمر اختصاصیت پرایمر بیشتر می­شود. اختصاصیت پرایمر به عوامل دیگری نیز بستگی دارد که در ادامه به آن اشاره خواهد شد.

طول مناسب پرایمر برای ژن­های کاربردی bp 24 -18 است و در این بازه، افزایش هر نوکلئوتید، موجب تقویت ۴ برابری اختصاصیت پرایمر می‌شود. کاهش طول این رشته‌ها به شدت بر توانایی اتصال اختصاصی آن‌ها اثرگذار خواهد بود، به طور‌یکه پرایمرهایی با طول کمتر از bp 15،‌ عملا به هر نقطه از ژنوم متصل می‌شوند. در شرایط خاص پرایمر می­تواند bp 45 – 40 طول داشته باشد. اما باید همواره به این نکته توجه داشته باشید که افزایش طول پرایمر،‌ موجب بیشتر شدن دمای مرحله annealing و زمان آن خواهد شد و علاوه بر این،‌ احتمال تشکیل ساختارهای ثانویه و پرایمر دایمرها را افزایش خواهد داد.

2- درصد GC

درصد GC در طول توالی پرایمر (GC Content)، درصد فراوانی نسبی نوکلئوتیدهای G و C را نشان می­دهد که مقدار بهینه این پارامتر 55 – 45% است.
ولی محدوده رایج استفاده از این پارامتر بین 60 – 40% است. هرگز مجاز نیستیم این پارامتر را 80% یا 20% داشته باشیم زیرا دمای annealing مستقیما تحت تاثیر درصد GC است. برای طراحی پرایمر با نرم افزار، باید یک maximum و minimum تعیین شود. که مطابق آنچه در بالا گفته شد تعیین می­شود. اگر درصد GC بیشتر از 60 باشد احتمالا پرایمر زمان جدا شدن از رشته الگو با مشکل مواجه می­شود. اگر مقدار این پاراکتر از 40 کمتر باشد احتمالا پرایمر نتواند بخوبی به رشته الگو متصل شود.

3- GC Clamp

نکته دیگری در در زمان طراحی پرایمر باید به آن توجه داشت پارامتر GC Clamp است که باید در انتهای ′3 پرایمر رعایت شود. Clamp به معنی گیره است. توصیه می­شود که در 5 نوکلئوتید آخر به سمت ′3، یک یا دو نوکلئوتید را گوانین یا سیتوزین انتخاب کرد (شکل 1). سمت ′3 پرایمر سمتی است که Taq پلی­مراز متصل می­شود و هر چه اتصال سمت ′3 پرایمر محکم­تر باشد DNA پلی­مراز شانس بیشتری برای اتصال و شروع واکنش دارد. این پارامتر کارایی واکنش PCR را افزایش می­دهد. نکته مهم دیگری که باید مد نظر قرار داد این است که تعداد G و C در 5 نوکلئوتید آخر سمت ′3 نباید بیشتر از دو عدد شود. زیرا زمینه را برای ایجاد
مشکلاتی مانند تشکیل دیمرهای پایدار در سر ′3 فراهم خواهد کرد.

4- دمای ذوب پرایمر

مهمترین نکته در طراحی پرایمر دقت به دمای Tm است که مخفف Theorical Melting point می ­باشد دمای ذوب پرایمر دمایی است که در آن دما P از دو رشته ­ای ها به صورت تک رشته­ ایی در آمده اند. این دما به اختصار Tm نامیده می­شود که توسط نرم افزار محاسبه می­گردد.

سوال اینجاست که چه عواملی روی دمای Tm موثر هستند و ما چگونه می­توانیم دمای Tm را دقیق محاسبه کنیم. اولین عاملی که روی دمای Tm تاثیر دارد GC content است که در بالا به آن اشاره شد. سیتوزین و گوانین پیوند هیدروژنی سه گانه باهم برقرار می­کنند اما آدنین و تیمین پیوند هیدروژنی دوگانه تشکیل می­دهند. هر چه درصد GC در پرایمر بیشتر باشد پرایمر با قدرت بیشتری به رشته الگو متصل می­شود و انرژی بیشتری برای جدا کردن پرایمر نیاز است. انرژی بیشتر یعنی دمای بیشتر و در نتیجه دمای Tm پرایمر بالاتر می­رود.

مورد بعدی که روی Tm پرایمر موثر است طول پرایمر است. هر چه پرایمر طولانی­ تر باشد میزان پایداری پیوند پرایمر با رشته الگو بیشتر می­شود. پس دمای بالاتری برای جدا کردن آن نیاز است و در نتیجه دمای Tm پرایمر بالاتر می­رود.

مورد آخری که روی دمای Tm تاثیر گذار است قدرت یونی بافر است. می­دانیم که رشته DNA غنی از بار منفی است که توسط فسفات حمل می­شود. دو بار هم­نام یکدیگر را دفع می­کنند پس سوال اینجاست که چرا دو رشته DNA همدیگر را دفع نمی­کنند و در سلول بسیار پایدار کنار همدیگر قرار می­گیرند. در سلول پروتئین­های هیستون وجود دارند که DNA را به دور خود می­پیچند. هیستون­ ها بار مثبت خیلی زیادی دارند که باعث می­شود بار منفی DNA خنثی شود و پایداری DNA در سلول بالا رود. اما در واکنش PCR هیستون­ها وجود ندارند. پس به جای هیستون­ها، یون­های مثبت را وارد واکنش PCR می­کنند. این یون­های مثبت می­توانند از بار منفی DNA کم کنند و در نتیجه پایداری اتصال دو رشته را بالا ببرند. وقتی پایداری اتصال دو رشته بیشتر می­شود دمای بالاتری برای جدا کردن دو رشه نیاز است در نتیجه دمای Tm پرایمرها هم بالاتر خواهد بود.

برای درک بیشتر قدرت یونی بافر به مثال زیر توجه کنید. فرض کنید دو محلول داریم که همه شرایط آنها یکسان است اما در محلول شماره 1 غلظت یون سدیم mM 100 و در محلول شماره 2 غلظت یون سدیم mM 50 است. قدرت یونی در محلولی که mM Na 100 وجود دارد بیشتر است. در نتیجه DNA در این محلول پایدار تر است. پس انرژی بیشتری برای اینکه پرایمر یا دو رشته DNA از هم جدا شوند نیاز است. در نتیجه Tm در محلول شماره 1 بیشتر است.

محاسبه Tm

فرمول­های زیادی برای محاسبه Tmارائه شده است که در اینجا چندتا از مهمترین آنها اشاره خواهد شد. اولین فرمول مربوط به مارمر و دوتی (Marmer and Doty) است. یک فرمول سنتی برای محاسبه Tm است. در این فرمول به ازای هر نوکلئوتید گوانین و سیتوزین ˚C 4 و به ازای هر نوکلئوتید آدنین و تیمین ˚C 2 برای Tm پرایمر در نظر گرفته می­شود که می­توان با یک جمع جبری ساده مقدار آن را محاسبه کرد.

T_m = 2(A+T) + 4(G+C)

مثال: توالی پرایمر 5′-CAATCGTACGGATCTAAG-3′ را در نظر بگیرید با توجه به فرمول بالا به صورت زیر محاسبه می­شود:

Tm = 2(10) 4(8) = 52˚C

در این فرمول هیچ کدام از عوامل طول پرایمر و قدرت یونی در این فرمول دیده نمی­شود. به همین دلیل این فرمول خیلی دقیق نیست. توصیه می­شود از این فرمول برای پرایمرهایی با طول بیشتر از bp 14 استفاده نشود.

فرمول دیگر، معادله Wallace است که در این معادله علاوه بر نوع نوکلئوتیدها طول توالی هم برای محاسبه Tmدر نظر گرفته می­شود.

اگر Tmهمان پرایمر قبلی با فرمول بالا محاسبه شود مقدار ˚C 76/45 بدست می­آید. Tmمحاسبه شده در این روش با مقدار قبلی متفاوت است. قطعا با در نظر گرفتن طول پرایمر، این Tmبه میزان واقعی ­تر نزدیک خواهد بود. اما ایرادی که در این فرمول وجود دارد این است که مثل فرمول قبلی عوامل دیگر موثر بر Tmدر این فرمول محاسبه نشده است. به همین دلیل فرمول Howlley برای محاسبه دمای Tmمعرفی شد.

در این معادله نه تنها تعداد و نوع نوکلئوتیدها برای محاسبه در نظر گرفته می­شود، بلکه قدرت یونی بافر نیز در این معادله گنجانده شده است. پس مقدار نمکی که در بافر وجود دارد را می­توان لحاظ کرد. فرض کنید غلظت یون سدیم M 05/0 است. بر این اساس مقدار Tmمحاسبه شده ˚C 57/51 بدست می­آید.

برای تخمین Tm در نرم افزارهای جدید برای پرایمرهای بلندتر، از تئوری ترمودینامیک نزدیک‌ترین همسایه (Nearest Neighbor Thermodynamic Theory) استفاده می‌شود که پیچیده‌تر از فرمول­های بالاست و با استفاده از نرم‌افزارهای طراحی پرایمر،‌ محاسبه می‌شود. این فرمول دقیق­ترین فرمول برای محاسبه Tm است. بررسی دانشمندان نشان داد که یکی از عوامل موثر بر دمای لازم برای جدا کردن دو نوکلئوتید از هم، نوع نوکلئوتیدهای همسایه است. میزان انرژی جدا شدن دو نوکلئوتید را در حالت­های مختلفی از نوکلئوتیدهای همسایه محاسبه کردند و جمع جبری این حالت­ها را بدست آوردند. عوامل دیگر مثل قدرت یونی مقدار پرایمر در محلول، مقدار منیزیم موجود در واکنش و … در محاسبات لحاظ کردند. این فرمول یک Tm دقیق از پرایمرها را ارائه می­دهد. اگر با نرم افزارطراحی پرایمر Oligo 7 این Tm محاسبه شود مقدار ˚C 79/50 بدست می­آید که بازهم با مقادیر محاسبه شده قبلی متفاوت است.

شواهد حاکی از آن است که معمولا، پرایمرهایی با Tm بین ˚C 52 تا 62 ، نتایج بهتری را در PCR نشان می‌دهند. دمای Tm نباید بیشتر از ˚C 65 باشد. دمای Tm از طول پرایمر و ترکیب بازی تبعیت می­کند. هر چه درصد GC بیشتر باشد Tm هم بیشتر می­شود. نکته بسیار مهم این است که اختلاف Tm دو پرایمر نباید بیشتر از ˚C 3 – 2 باشد.

5- دمای اتصال پرایمر به الگو

دمای اتصال پرایمر به الگو (Primer Annealing Temperature)که به اختصار Ta نامیده می­شود و با Tm ارتباط دارد. اگر دمای Ta بیش از حد بالا باشد منجر به ایجاد محصول ضعیف در PCR می­شود که بدان معناست که این پرایمرها ناکارآمد هستند. اگر دمای Ta بیش از حد پایین باشد باعث تولید محصولات غیر اختصاصی می­شود. دمای Ta از فرمول زیر بدست می­آید:

در این فرمول Tm پرایمر: دمای ذوب ناپایدارترین دوپلکس پرایمر- الگو و Tm محصول: دمای ذوب محصول PCR می­باشد. همانطور که از این فرمول پیداست، دمای annealing، همواره پایین‌تر از دمای ذوب خواهد بود. در آزمایشگاه، معمولا دمای annealing، ˚C ۲ تا ۴، کمتر از دمای Tm در نظر گرفته می‌شود.

6- طول قطعه تکثیری

با طراحی یک جفت پرایمر forward و reverse اندازه قطعه تکثیری تعیین می­شود. که بطور کلی طول قطعه تکثیری بین bp 1000 – 300 است. بهتر است که طول قطعه تکثیری از kb 3 بیشتر نباشد. پرایمرهایی که برای Real Time طراحی می­شوند بهتر است طولی بین bp 150 – 50 تکثیر کنند. از پرایمرهایی که طول قطعه تکثیری آنها بیشتر از bp 400 است اجتناب شود.

مواردی که باید در طراحی پرایمر اجتناب کرد

مواردی که در هنگام طراحی پرایمر باید از آنه ا اجتناب کرد در ادامه توضیح داده خواهند شد. عدم رعایت این موارد کارایی و اختصاصیت پرایمر طراحی شده را بشدت کاهش می­ دهند. این موارد شامل وجود ساختارهای ثانویه، توالی­ های تکراری و وجود تکرارهای چندتایی از یک نوکلئوتید است.

1- ساختارهای ثانویه (Secondary Structures)

ساختارهای ثانویه در اثر برهمکنش‌های بین مولکولی و درون مولکولی ایجاد می‌شوند و یک یا هر دو پرایمر را از دسترس آنزیم پلیمراز خارج می‌کنند. این مسئله موجب کاهش چشم گیر میزان محصول خواهد شد .اولین ساختار ثانویه احتمالی که برای پرایمر طراحی شده ممکن است تشکیل شود دایمر (dimer) است. دایمر یعنی اینکه پرایمرها بصورت تکمیل کننده هم طراحی می­ شوند (شکل 1) و به هم می­ چسبند که این موضوع اصلا برای PCR مطلوب نیست.
تشکیل دایمرها کیفیت PCR را پایین می­ آورد. این مورد را نرم افزارهای مختلف بررسی می­کند و نرم افزار به شما میگوید که پرایمرهای طراحی شده دایمر تشکیل می­دهند یانه. اگر دو پرایمر forward و Reverse تشکیل دایمر دهند cross dimer نامیده می­شود.
این ساختارها در اثر برهم‌کنش بین دو پرایمر از یک نوع رخ می‌دهند. زمانی که دو پرایمر forward و یا دو پرایمر Reverseبه هم می چسبند self dimer ایجاد می­ شود. که self dimerهایی که در انتهای ′3 تشکیل می­شوند بسیار خطرناک هستند.

همان طور که می‌دانیم، فراوانی پرایمرها در مخلوط واکنش، ‌بسیار بیشتر از ژن هدف است. در این حالت، اگر مثلا پرایمر forward طوری طراحی شود که بخشی از توالی آن، مکمل بخش دیگر باشد، در مرحله annealing، به جای اتصال به مولکول الگو،‌ به پرایمر همتای دیگر متصل خواهد شد و آنزیم نیز، رشته جدیدی را از روی آن سنتز خواهد کرد. نتیجه این امر، خارج شدن پرایمر از دسترس الگو است که به ضعیف شدن باند محصول در ژل الکتروفورز منجر می‌شود. در عوض، باندهای کوتاهی در پایین ژل الکتروفورز دیده می‌شوند که در نتیجه یک تکثیر اشتباهی ایجاد شده‌اند.

اگر یک پرایمر از انتهای ′3 یا ′5 روی خودش تا بخورد تشکیل hairpin می­ دهد (شکل 2).

عمدتا نرم افزارها پایداری ساختارهای ثانویه را با عدد ΔG نشان می­ دهند. این عدد بیانگر انرژی مورد نیاز برای شکستن آن ساختار است. هرچه ΔG منفی تر باشد ساختار پایدارتر است و باید از آن پرایمر صرف نظر کرد. ΔG بزرگتر از kcal/mol 5- عدد قابل قبول برای انواع دایمر است. برای قسمت وسط دایمرها مقدار ΔG باید بزرگتر kcal/mol 6- از باشد. عدد ΔG قابل قبول برای ساختار ثانویه Hairpin بزرگتر از kcal/mol 2- در انتهای پرایمر و kcal/mol 3- برای وسط پرایمر است.

2- توالی های تکراری (Repeats)

یکی از مواردی که در زمان طراحی پرایمر باید از آن اجتناب کرد این است که وقتی روی رشته الگو یک تکرار دیده می­شود از آن قسمت پرایمر طراحی نشود. این پارامتر نوکلئوتیدهای دوتایی تکراری را نشان می­دهد. مثلا روی رشته الگو 5′-GCATATATATATCGT-3′ را در نظر بگیرید. توالی AT چندبار تکرار شده است سعی شود از این بخش طراحی انجام نشود. توالی‌های تکراری،‌ احتمال تشکیل self-dimer را به شدت افزایش می‌دهند. یک پرایمر،‌ حداکثر مجاز به حمل 3 دی-نوکلئوتید تکراری است.

3- توالی های تکراری پشت سر هم (Run)

وقتی مشاهده می­شود که روی رشته الگو یک نوکلئوتید به تعداد زیادی تکرار شده است (بیشتر از 3 تا) نباید آن بخش را به عنوان پرایمر انتخاب کرد. به این تکرارهای پی در پی Run می­گویند. مثلا اگر سه تا G پشت سر هم تکرار شود G-Run نامیده می­شود. چنین تکرارهایی،‌ احتمال اتصال اشتباه پرایمر را افزایش می‌دهند.