کالیبراسیون ترمال سایکلر
با توجه به کاربردی که دستگاه ترمال سایکلر(Thermal Cycler) در مراکز مختلف علمی و تحقیقاتی و درمانی دارد ، لازم است که متغیرهای وابسته به دستگاه همیشه تحت کنترل بوده و دستگاه ترموسایکلر مورد نظر در بهینه ترین وضعیت خود قرار داشته باشد تا محقق بتواند نتایج مطمعن تری را در خروجی دریافت کند. آزمایشگاه های مولکولی و تشخیص مولکولی جهت انجام آزمایش PCR از دستگاه ترمال سایکلر استفاده می کنند که برای اطمینان از صحت انجام کار لازم است به صورت دوره ای کالیبراسیون ترمال سایکلر انجام شود.
نکاتی که برای خرید ترموسایکلر باید حتما بدانید.
کالیبراسیون دمایی یک دستگاه ترمال سایکلر
نرخ رمپ و تاثیر آن بر واکنش PCR در فرایند کالیبراسیون ترمال سایکلر
یکی از پارامترهای مهم در کالیبراسیون ترمال سایکلر نرخ رمپ است. نرخ رمپ ترموسایکلر، سرعت رسیدن به دمای تنظیم شده را مشخص می کند. هرچه نرخ رمپ بیشتر باشد سرعت انجام واکنش PCR سریعتر است و در یک زمان معین تعداد سیکل بیشتری از واکنش PCR طی می شود.
نرخ رمپ گرمادهی در کالیبراسیون ترمال سایکلر چیست؟
نرخ رمپ دمایی در ترموسایکلر، تغییر دما از یک فاصله زمانی معین می باشد که با فرمول Ramp Rate=AT/At با واحد oC/sec محاسبه می شود.
چه تعداد سیکل برای انجام واکنش PCR در کالیبراسیون ترمال سایکلر لازم است؟
در آزمایش PCR و برای کالیبراسیون ترمال سایکلر در حالت ایده ال نرخ افزایش قطعات DNA به صورت توان 2 میزان اولیه DNA می باشد. هر چه مقدار اولیه مولکول های DNA بیشتر باشد میزان سیکل های مورد نیاز جهت تکثیر به میزان مناسب کمتر می باشد. نهایتا در صورتی که دمای مربوط به گام های مختلف PCR بهینه شده باشد بین 25 تا 40 سیکل ، بسته به میزان اولیه مولکول های DNA به اندازه کافی تکثیر صورت می گیرد.
برای کالیبراسیون ترمال سایکلر چه تعداد پرایمر در واکنش PCR مورد استفاده قرار می گیرد؟
در هر واکنش PCR دو پرایمر مورد استفاده قرار می گیرد؛ این پرایمرها به گونه ای طراحی شده اند که می توانند در دو طرف ناحیه DNA مورد نظر قرار بگیرند. پرایمر فوروارد به کدون استارت رشته الگو متصل می شود و پرایمر reverse به کدون استاپ متصل می شود. انتهای ‘5 هر دو پرایمر به انتهای 3’ رشته الگو متصل می شود.
چرا بافر در واکنش PCR استفاده می شود؟
واکنش PCR در یک محیط بافری که محیط شیمیایی مناسب جهت انجام فعالیت DNA Polymerase فراهم می کند صورت می گیرد. pH بافر معمولا بین 8 تا 9.5 است و اغلب با استفاده از Tris-HCl پایدار می شود. یون پتاسیم آزاد شده از ترکیب KCl یک ترکیب ضروری این بافر هست که موجب بهبود اتصال پرایمرها به رشته های هدف می شود.
در صورتی که تنها یک پرایمر در محیط باشد چه اتفاقی می افتد؟
در صورت بروز چنین مساله ای، یک فرایند به نام asymmetric PCR اتفاق می افتد. طی این پروسه فقط یک رشته از مولکول DNA دورشته ای هدف تکثیر می شود و هربار طی هر سیکل یک کپی از مولکول هدف سنتز می شود. در واقع رشد و تکثیر نمایی مولکول DNA اتفاق نمی افتد و مقادیر فوق العاده کمی از مولکول هدف تکثیر خواهد شد.
علت استفاده از یون MgCl2 در فرایند PCR
یون MgCl2 (منیزیم کلرید) یک ترکیب ضروری در مسترمیکس PCR می باشد که به عنوان کوفاکتور موجب افزایش فعالیت آنزیمی DNA Polymerase می شود و از این رو موجب افزایش و بهبود تکثیر DNA میشود. کوفاکتورها یون های غیرپروتئینی و یا مولکول هایی هستند که به آنزیم ها جهت بهبود فعالیت شان کمک می کنند. این یون عملا در واکنش مصرف نمی شود و تنها یک کمک کننده جهت انجام واکنش می باشد. در صورتی که یون منیزیم بیشتری در محیط باشد سرعت انجام واکنش بیشتر می شود. در نظر گرفته شود که این امر لزوما خوب نیست و اگر منیزیم خیلی زیادی در محیط واکنش موجود باشد تگ پلیمراز خیلی سریع عمل می کند و هنگام تکثیر موجب بروز خطا و جهش بیشتر می شود.
اما در صورتی که یون منیزیم در محیط کم باشد موجب کاهش سرعت پلیمریزاسیون آنزیم تک پلیمراز می شود. همین امر باعث می شود در انتهای واکنش PCR میزان کمتری از کپی DNA در محیط موجود باشد. در صورتی که به میزان کافی یون منیزیم در محیط نباشد بعضی از آنزیم های DNA Pol فعال نمی شوند و نهایتا کار نخواهند کرد.
