در واکنش PCR، پرایمرها نقشی کلیدی در تعیین ناحیه هدف DNA برای تکثیر دارند. طراحی دقیق و اصولی پرایمر، تأثیر مستقیم بر کارایی، اختصاصیت و دقت PCR دارد. آشنایی با اصول اولیه طراحی پرایمر، مانند طول مناسب، دمای ذوب، محتوای GC و جلوگیری از ساختارهای ثانویه، برای موفقیت در این تکنیک ضروری است.
در طراحی پرایمر هیچ DNA پلیمرازی قادر به ساختن DNA نیست و همه DNA پلیمرازها به یک انتهای OH ‘3 نیاز دارند تا بتوانند تکثیر را از روی DNA الگو انجام دهند. به همین دلیل برای تکثیر DNA چه در درون سلول و چه در محیط in vitro نیاز به پرایمر (primer است. در واقع پرایمر توالی کوتاهی از جنس DNA است که با ایجاد یک انتهای OH ‘3 جایگاهی برای فعالیت آنزیم DNA پلیمراز ایجاد میکند تا بتواند از رشته الگو سنتز را ادامه دهد. برای تکثیر یک قطعه نیاز به دو پرایمر است که Forward و Reverse نام دارند و با حروف اختصاری F و R نشان داده میشوند. اتصال پرایمرها به مولکول الگو بر پایه پیوندهای هیدروژنی استوار است. DNA دو رشته ایی است و ژن روی یکی از دو رشته قرار دارد. رشته ایی که توالی ژن روی آن قرار دارد رشته sense و رشته مقابل آن anti-sense نامیده میشود. پرایمر Forward برای رشته sense طراحی می شود. در مقابل، برای سنتز رشته Anti-sense پرایمر Reverse طراحی میشود. در واقع جهت انجام فرایند تکثیر DNA در دستگاه ترموسایکلر لازم است طراحی پرایمر به خوبی صورت گرفته باشد.
1- محدود کردن تکثیر: برای اینکه یک قطعه خاصی از ژنوم را تکثیر کنیم با توجه به توالی DNA الگو پرایمر طراحی کرده و محل دقیق تکثیر را مشخص می کنیم. مثلا زمانی که هدف تکثیر یک ژن خاص است باید ابتدا و انتهای ژن را بدانیم و از قسمت ابتدا و انتهای ژن طراحی پرایمر انجام شود تا بتوان با استفاده از PCR این ژن را تکثیر کرد و آن را در موجود دیگری کلون کرد.
2- گاهی هدف اثبات وجود یا عدم وجود یک ژن در ارگانیسم است. برای این هدف نیازی نیست که حتما از ابتدا و انتهای ژن طراحی پرایمر انجام شود. میتوان از قسمت های مختلف ژن پرایمری با کارایی و اختصاصیت بالا طراحی کرد که بسته به طول ژن میتوان از وسط یا قسمت های دیگر ژن طراحی را انجام داد. ولی در مورد قبل که در بالا ذکر گردید حتما باید از ابتدا و انتهای ژن طراحی انجام شود.
3- پرایمرها برای نقشه یابی ژنوم نیز کاربرد دارند. برای نقشه یابی ژنوم از پرایمرهای تصادفی استفاده می شود.
پرایمرهای طراحی شده باید دو ویژگی اصلی و مهم را دارا باشند. کارایی پرایمر یا Efficiency پرایمر یک ویژگی است که نشان می دهد یک پرایمر تا چه حد در اتصال به ناحیه هدف و تکثیر قطعه مورد نظر و ایجاد محصول نهایی موفق بوده است. هر چه کارایی پرایمر بالاتر باشد، باند قویتری در ژل الکتروفورز مشاهده خواهد شد.
ویژگی دوم اختصاصیت یا Specificity است که به این معنی است که پرایمر تنها به توالی مورد نظر متصل میشود و نه هیچ جای دیگری از DNA الگو. بنابراین برای پرایمرهای با اختصاصیت بالا، در الکتروفورز تنها یک باند مشاهده میشود. برای حفظ این دو ویژگی در طراحی پرایمر باید نکاتی را در حین طراحی رعایت کرد این نکات شامل: طول پرایمر ، محتوای GC، GC Clamp، دمای Tm، دمای اتصال پرایمر به رشته الگو و طول قطعه تکثیری است که در ادامه توضیح داده خواهند شد.
در تکنیکهای مولکولی مانند PCR، طراحی صحیح پرایمرها نقش کلیدی در دقت و کارایی واکنش دارد. پرایمرها قطعات کوتاه DNA هستند که به عنوان نقطه شروع سنتز رشته جدید توسط DNA پلیمراز عمل میکنند. طراحی پرایمر باید بهگونهای باشد که بهطور اختصاصی به ناحیه هدف متصل شده و از تشکیل محصولات غیراختصاصی یا دایمر پرایمرها جلوگیری کند. در ادامه به مهمترین نکات در طراحی پرایمر اشاره میشود.
به منظور تکثیر توالی DNA مد نظر محقق در دستگاه ترموسایکلر (دستگاه PCR) لازم است که طول بهینه ای از پرایمر طراحی گردد. طول پرا یمر فاکتوری است که بر اختصاصی بودن پرایمر تاثیر زیادی دارد. بطور کلی DNA از 4 نوع باز تشکیل شده است که طبق قانون احتمالات، احتمال حضور هر کدام از این نوکلئوتیدها برابر یک چهارم است. اگر توالی پرایمر مورد نظر از 10 نوکلئوتید تشکیل شده باشد احتمال وجود چنین توالی روی DNA الگو برابر با یک چهارم به توان 10 است. این بدین معناست که از هر یک میلیون باز، یک توالی مشابه توالی 10تایی پرایمر ما وجود دارد. ژنوم E. Coli حدود 6/4 میلیارد باز تشکیل شده است، پس احتمال وجود پرایمر 10 جفت بازی ما در این ژنوم برابر 6/4 است. به عبارت دیگر 6/4 بار احتمال دارد که پرایمر ما روی ژنوم تکرار شود. اگر طول پرایمر 20 نوکلئوتید شود این پرایمر از هر 50 میلیارد باز میتواند جایگاه خود را پیدا کند. در نتیجه با افزایش طول پرایمر اختصاصیت پرایمر بیشتر میشود. اختصاصیت پرایمر به عوامل دیگری نیز بستگی دارد که در ادامه به آن اشاره خواهد شد.
طول مناسب پرایمر برای ژنهای کاربردی bp 24 -18 است و در این بازه، افزایش هر نوکلئوتید، موجب تقویت ۴ برابری اختصاصیت پرایمر میشود. کاهش طول این رشتهها به شدت بر توانایی اتصال اختصاصی آنها اثرگذار خواهد بود، به طوریکه پرایمرهایی با طول کمتر از bp 15، عملا به هر نقطه از ژنوم متصل میشوند. در شرایط خاص پرایمر میتواند bp 45 – 40 طول داشته باشد. اما باید همواره به این نکته توجه داشته باشید که افزایش طول پرایمر، موجب بیشتر شدن دمای مرحله annealing و زمان آن خواهد شد و علاوه بر این، احتمال تشکیل ساختارهای ثانویه و پرایمر دایمرها را افزایش خواهد داد.
درصد GC در طول توالی پرایمر (GC Content)، درصد فراوانی نسبی نوکلئوتیدهای G و C را نشان میدهد که مقدار بهینه این پارامتر 55 – 45% است.
ولی محدوده رایج استفاده از این پارامتر بین 60 – 40% است. هرگز مجاز نیستیم این پارامتر را 80% یا 20% داشته باشیم زیرا دمای annealing مستقیما تحت تاثیر درصد GC است. برای طراحی پرایمر با نرم افزار، باید یک maximum و minimum تعیین شود. که مطابق آنچه در بالا گفته شد تعیین میشود. اگر درصد GC بیشتر از 60 باشد احتمالا پرایمر زمان جدا شدن از رشته الگو با مشکل مواجه میشود. اگر مقدار این پاراکتر از 40 کمتر باشد احتمالا پرایمر نتواند بخوبی به رشته الگو متصل شود.
نکته دیگری در در زمان طراحی پرایمر باید به آن توجه داشت پارامتر GC Clamp است که باید در انتهای ′3 پرایمر رعایت شود. Clamp به معنی گیره است. توصیه میشود که در 5 نوکلئوتید آخر به سمت ′3، یک یا دو نوکلئوتید را گوانین یا سیتوزین انتخاب کرد (شکل 1). سمت ′3 پرایمر سمتی است که Taq پلیمراز متصل میشود و هر چه اتصال سمت ′3 پرایمر محکمتر باشد DNA پلیمراز شانس بیشتری برای اتصال و شروع واکنش دارد. این پارامتر کارایی واکنش PCR را افزایش می دهد. نکته مهم دیگری که باید مد نظر قرار داد این است که تعداد G و C در 5 نوکلئوتید آخر سمت ′3 نباید بیشتر از دو عدد شود. زیرا زمینه را برای ایجاد مشکلاتی مانند تشکیل دیمرهای پایدار در سر ′3 فراهم خواهد کرد.
مهمترین نکته در طراحی پرایمر دقت به دمای Tm است که مخفف Theorical Melting point می باشد دمای ذوب پرایمر دمایی است که در آن دما P از دو رشته ای ها به صورت تک رشته ایی در آمده اند. این دما به اختصار Tm نامیده میشود که توسط نرم افزار محاسبه میگردد.
سوال اینجاست که چه عواملی روی دمای Tm موثر هستند و ما چگونه میتوانیم دمای Tm را دقیق محاسبه کنیم. اولین عاملی که روی دمای Tm تاثیر دارد GC content است که در بالا به آن اشاره شد. سیتوزین و گوانین پیوند هیدروژنی سه گانه باهم برقرار میکنند اما آدنین و تیمین پیوند هیدروژنی دوگانه تشکیل میدهند. هر چه درصد GC در پرایمر بیشتر باشد پرایمر با قدرت بیشتری به رشته الگو متصل میشود و انرژی بیشتری برای جدا کردن پرایمر نیاز است. انرژی بیشتر یعنی دمای بیشتر و در نتیجه دمای Tm پرایمر بالاتر میرود.
مورد بعدی که روی Tm پرایمر موثر است طول پرایمر است. هر چه پرایمر طولانی تر باشد میزان پایداری پیوند پرایمر با رشته الگو بیشتر میشود. پس دمای بالاتری برای جدا کردن آن نیاز است و در نتیجه دمای Tm پرایمر بالاتر میرود.
مورد آخری که روی دمای Tm تاثیر گذار است قدرت یونی بافر است. میدانیم که رشته DNA غنی از بار منفی است که توسط فسفات حمل میشود. دو بار همنام یکدیگر را دفع میکنند پس سوال اینجاست که چرا دو رشته DNA همدیگر را دفع نمیکنند و در سلول بسیار پایدار کنار همدیگر قرار میگیرند. در سلول پروتئینهای هیستون وجود دارند که DNA را به دور خود میپیچند. هیستون ها بار مثبت خیلی زیادی دارند که باعث میشود بار منفی DNA خنثی شود و پایداری DNA در سلول بالا رود. اما در واکنش PCR هیستونها وجود ندارند. پس به جای هیستونها، یونهای مثبت را وارد واکنش PCR میکنند. این یونهای مثبت میتوانند از بار منفی DNA کم کنند و در نتیجه پایداری اتصال دو رشته را بالا ببرند. وقتی پایداری اتصال دو رشته بیشتر میشود دمای بالاتری برای جدا کردن دو رشه نیاز است در نتیجه دمای Tm پرایمرها هم بالاتر خواهد بود.
برای درک بیشتر قدرت یونی بافر به مثال زیر توجه کنید. فرض کنید دو محلول داریم که همه شرایط آنها یکسان است اما در محلول شماره 1 غلظت یون سدیم mM 100 و در محلول شماره 2 غلظت یون سدیم mM 50 است. قدرت یونی در محلولی که mM Na 100 وجود دارد بیشتر است. در نتیجه DNA در این محلول پایدار تر است. پس انرژی بیشتری برای اینکه پرایمر یا دو رشته DNA از هم جدا شوند نیاز است. در نتیجه Tm در محلول شماره 1 بیشتر است.
فرمولهای زیادی برای محاسبه Tmارائه شده است که در اینجا چندتا از مهمترین آنها اشاره خواهد شد. اولین فرمول مربوط به مارمر و دوتی (Marmer and Doty) است. یک فرمول سنتی برای محاسبه Tm است. در این فرمول به ازای هر نوکلئوتید گوانین و سیتوزین ˚C 4 و به ازای هر نوکلئوتید آدنین و تیمین ˚C 2 برای Tm پرایمر در نظر گرفته میشود که میتوان با یک جمع جبری ساده مقدار آن را محاسبه کرد.
Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
مثال: توالی پرایمر 5′-CAATCGTACGGATCTAAG-3′ را در نظر بگیرید با توجه به فرمول بالا به صورت زیر محاسبه میشود:
Tm = 2(10) 4(8) = 52˚C
در این فرمول هیچ کدام از عوامل طول پرایمر و قدرت یونی در این فرمول دیده نمیشود. به همین دلیل این فرمول خیلی دقیق نیست. توصیه میشود از این فرمول برای پرایمرهایی با طول بیشتر از bp 14 استفاده نشود.
فرمول دیگر، معادله Wallace است که در این معادله علاوه بر نوع نوکلئوتیدها طول توالی هم برای محاسبه Tmدر نظر گرفته میشود.
اگر Tmهمان پرایمر قبلی با فرمول بالا محاسبه شود مقدار ˚C 76/45 بدست میآید. Tmمحاسبه شده در این روش با مقدار قبلی متفاوت است. قطعا با در نظر گرفتن طول پرایمر، این Tmبه میزان واقعی تر نزدیک خواهد بود. اما ایرادی که در این فرمول وجود دارد این است که مثل فرمول قبلی عوامل دیگر موثر بر Tmدر این فرمول محاسبه نشده است. به همین دلیل فرمول Howlley برای محاسبه دمای Tmمعرفی شد.
در این معادله نه تنها تعداد و نوع نوکلئوتیدها برای محاسبه در نظر گرفته میشود، بلکه قدرت یونی بافر نیز در این معادله گنجانده شده است. پس مقدار نمکی که در بافر وجود دارد را میتوان لحاظ کرد. فرض کنید غلظت یون سدیم M 05/0 است. بر این اساس مقدار Tmمحاسبه شده ˚C 57/51 بدست میآید.
برای تخمین Tm در نرم افزارهای جدید برای پرایمرهای بلندتر، از تئوری ترمودینامیک نزدیکترین همسایه (Nearest Neighbor Thermodynamic Theory) استفاده میشود که پیچیدهتر از فرمولهای بالاست و با استفاده از نرمافزارهای طراحی پرایمر، محاسبه میشود. این فرمول دقیقترین فرمول برای محاسبه Tm است. بررسی دانشمندان نشان داد که یکی از عوامل موثر بر دمای لازم برای جدا کردن دو نوکلئوتید از هم، نوع نوکلئوتیدهای همسایه است. میزان انرژی جدا شدن دو نوکلئوتید را در حالتهای مختلفی از نوکلئوتیدهای همسایه محاسبه کردند و جمع جبری این حالتها را بدست آوردند. عوامل دیگر مثل قدرت یونی مقدار پرایمر در محلول، مقدار منیزیم موجود در واکنش و … در محاسبات لحاظ کردند. این فرمول یک Tm دقیق از پرایمرها را ارائه میدهد. اگر با نرم افزارطراحی پرایمر Oligo 7 این Tm محاسبه شود مقدار ˚C 79/50 بدست میآید که بازهم با مقادیر محاسبه شده قبلی متفاوت است.
شواهد حاکی از آن است که معمولا، پرایمرهایی با Tm بین ˚C 52 تا 62 ، نتایج بهتری را در PCR نشان میدهند. دمای Tm نباید بیشتر از ˚C 65 باشد. دمای Tm از طول پرایمر و ترکیب بازی تبعیت میکند. هر چه درصد GC بیشتر باشد Tm هم بیشتر میشود. نکته بسیار مهم این است که اختلاف Tm دو پرایمر نباید بیشتر از ˚C 3 – 2 باشد.
دمای اتصال پرایمر به الگو (Primer Annealing Temperature)که به اختصار Ta نامیده میشود و با Tm ارتباط دارد. اگر دمای Ta بیش از حد بالا باشد منجر به ایجاد محصول ضعیف در PCR میشود که بدان معناست که این پرایمرها ناکارآمد هستند. اگر دمای Ta بیش از حد پایین باشد باعث تولید محصولات غیر اختصاصی میشود. دمای Ta از فرمول زیر بدست میآید:
در این فرمول Tm پرایمر: دمای ذوب ناپایدارترین دوپلکس پرایمر- الگو و Tm محصول: دمای ذوب محصول PCR میباشد. همانطور که از این فرمول پیداست، دمای annealing، همواره پایینتر از دمای ذوب خواهد بود. در آزمایشگاه، معمولا دمای annealing، ˚C ۲ تا ۴، کمتر از دمای Tm در نظر گرفته میشود.
با طراحی یک جفت پرایمر forward و reverse اندازه قطعه تکثیری تعیین میشود. که بطور کلی طول قطعه تکثیری بین bp 1000 – 300 است. بهتر است که طول قطعه تکثیری از kb 3 بیشتر نباشد. پرایمرهایی که برای Real Time طراحی میشوند بهتر است طولی بین bp 150 – 50 تکثیر کنند. از پرایمرهایی که طول قطعه تکثیری آنها بیشتر از bp 400 است اجتناب شود.
مواردی که در هنگام طراحی پرایمر باید از آنه ا اجتناب کرد در ادامه توضیح داده خواهند شد. عدم رعایت این موارد کارایی و اختصاصیت پرایمر طراحی شده را بشدت کاهش می دهند. این موارد شامل وجود ساختارهای ثانویه، توالی های تکراری و وجود تکرارهای چندتایی از یک نوکلئوتید است.
ساختارهای ثانویه در اثر برهمکنشهای بین مولکولی و درون مولکولی ایجاد میشوند و یک یا هر دو پرایمر را از دسترس آنزیم پلیمراز خارج میکنند. این مسئله موجب کاهش چشم گیر میزان محصول خواهد شد .اولین ساختار ثانویه احتمالی که برای پرایمر طراحی شده ممکن است تشکیل شود دایمر (dimer) است. دایمر یعنی اینکه پرایمرها بصورت تکمیل کننده هم طراحی می شوند (شکل 1) و به هم می چسبند که این موضوع اصلا برای PCR مطلوب نیست.
تشکیل دایمرها کیفیت PCR را پایین می آورد. این مورد را نرم افزارهای مختلف بررسی می کند و نرم افزار به شما میگوید که پرایمرهای طراحی شده دایمر تشکیل میدهند یانه. اگر دو پرایمر forward و Reverse تشکیل دایمر دهند cross dimer نامیده میشود.
این ساختارها در اثر برهمکنش بین دو پرایمر از یک نوع رخ میدهند. زمانی که دو پرایمر forward و یا دو پرایمر Reverseبه هم می چسبند self dimer ایجاد می شود. که self dimerهایی که در انتهای ′3 تشکیل میشوند بسیار خطرناک هستند.
همان طور که میدانیم، فراوانی پرایمرها در مخلوط واکنش، بسیار بیشتر از ژن هدف است. در این حالت، اگر مثلا پرایمر forward طوری طراحی شود که بخشی از توالی آن، مکمل بخش دیگر باشد، در مرحله annealing، به جای اتصال به مولکول الگو، به پرایمر همتای دیگر متصل خواهد شد و آنزیم نیز، رشته جدیدی را از روی آن سنتز خواهد کرد. نتیجه این امر، خارج شدن پرایمر از دسترس الگو است که به ضعیف شدن باند محصول در ژل الکتروفورز منجر میشود. در عوض، باندهای کوتاهی در پایین ژل الکتروفورز دیده میشوند که در نتیجه یک تکثیر اشتباهی ایجاد شدهاند.
اگر درون یک پرایمر، بخشهایی وجود داشته باشد که مکمل یکدیگرند، ممکن است ساختارهای ثانویهای مانند سنجاقسری (hairpin) تشکیل شود که از اتصال صحیح پرایمر به DNA هدف جلوگیری میکند. همچنین، اگر دو پرایمر (Forward و Reverse) مکمل یکدیگر باشند، ممکن است بهجای اتصال به رشتهی هدف، به هم متصل شوند و دایمرهای پرایمری (primer-dimers) بسازند. این دایمرها منابع واکنش را مصرف میکنند و میتوانند نتیجهی PCR را بهطور کامل مختل کنند.
اگر دو پرایمر دارای توالیهای مشابه یا مکمل یکدیگر باشند، بهویژه در ناحیهی ۳’، احتمال تشکیل دایمر پرایمر افزایش مییابد. این دایمرها در ژل الکتروفورز معمولاً بهصورت باندهایی با اندازه بسیار کوچک ظاهر میشوند و منجر به کاهش کارایی و اختصاصیت PCR میگردند.
اگر چندین باز G یا C در انتهای ۳’ پرایمر قرار داشته باشند، ممکن است اتصال ناپایدار یا غیراختصاصی به نواحی غیرهدف در ژنوم ایجاد شود، چون G و C با سه پیوند هیدروژنی به هم متصل میشوند و پایداری بالاتری دارند. به همین دلیل توصیه میشود در طراحی، از کشیدگیهای متوالی G یا C در انتهای پرایمر اجتناب شود، در عوض یک یا دو باز G/C در انتهای ۳’ برای اتصال مناسب کافی است.
پرایمرهای بسیار کوتاه (کمتر از ۱۸ نوکلئوتید) معمولاً اختصاصیت کافی ندارند و ممکن است به نواحی متعددی از ژنوم متصل شوند. از طرفی، پرایمرهای خیلی بلند (بیشتر از ۳۰ نوکلئوتید) میتوانند منجر به افزایش احتمال تشکیل ساختارهای ثانویه و کاهش بازدهی واکنش شوند. بهطور معمول، طول ایدهآل پرایمر بین ۱۸ تا ۲۵ نوکلئوتید است، که تعادلی بین اختصاصیت و دمای ذوب مناسب ایجاد میکند.