فرآیند ریل تایم پی سی آر و کاربردهایش

ریل تایم پی سی آر یا qPCR، نوعی از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) است که امکان مشاهده و اندازه‌گیری میزان تکثیر DNA را در هر مرحله از واکنش فراهم می‌کند. برخلاف PCR معمولی که در آن محصول نهایی PCR در پایان واکنش بررسی می‌شود، در Real-Time PCR، تکثیر DNA به صورت لحظه‌ای و با استفاده از مواد فلورسنت قابل ردیابی است. این ویژگی، Real-Time PCR را به روشی بسیار دقیق و حساس برای تعیین مقدار DNA یا RNA موجود در نمونه‌های مختلف تبدیل کرده است.

ریل تایم پی‌سی‌آر چیست؟

ریل تایم پی سی آر که به آن qPCR یا PCR کمی نیز می‌گویند، تکنیکی در زیست‌شناسی مولکولی است که برای تکثیر و اندازه‌گیری مقدار DNA یا RNA در یک نمونه به صورت همزمان استفاده می‌شود. برخلاف PCR معمولی که فقط وجود یا عدم وجود قطعه DNA مورد نظر را در انتهای واکنش مشخص می‌کند، Real-Time PCR امکان مشاهده و اندازه‌گیری میزان تکثیر DNA را در هر چرخه فراهم می‌کند. این کار با استفاده از پروب‌های فلورسنت انجام می‌شود که با افزایش مقدار DNA تکثیر شده، نور بیشتری ساطع می‌کنند. دستگاه پی سی آر کمی یا ریل تایم پی سی آر با پی سی آر معمولی متفاوت است. ریل تایم پی سی آر کاربردهای گسترده‌ای در تحقیقات، تشخیص پزشکی و صنایع مختلف دارد.

تفاوت Real-Time PCR با PCR سنتی

Real-Time PCR در واقع توسعه یافته PCR سنتی است و تفاوت اصلی آن‌ با PCR سنتی در نحوه تشخیص و اندازه‌گیری محصول نهایی است:

•    PCR سنتی: در PCR سنتی، DNA  در دستگاه ترموسایکلر تکثیر می‌شود، اما نتیجه آن تا انتهای واکنش مشخص نمی‌شود. بنابراین برای مشاهده نتیجه باید تا پایان واکنش صبر کنید. معمولاً برای بررسی نتایج واکنش PCR بعد از اتمام آن، از ژل الکتروفورز استفاده می‌شود. این روش فقط نشان می‌دهد که آیا قطعه DNA مورد نظر تکثیر شده است یا نه، و نمی‌تواند مقدار دقیق آن را در نمونه اولیه مشخص کند.

•   Real-Time PCR : در ریل تایم پی سی آر، تکثیر DNA در طول واکنش و به صورت لحظه‌ای اندازه‌گیری می‌شود. این کار با استفاده از مواد فلورسنت انجام می‌شود که با افزایش مقدار DNA تکثیر شده، نور بیشتری ساطع می‌کنند. دستگاه ریل تایم پی‌سی‌آر این نور را در هر چرخه اندازه‌گیری کرده و مقدار DNA را به صورت دقیق مشخص می‌کند.

به همین دلیل Real-Time PCR در مواردی که نیاز به اندازه‌گیری دقیق مقدار DNA یا RNA باشد، مانند تشخیص بار ویروسی یا بررسی میزان بیان ژن بسیار کاربردی است.

کاربردهای اصلی ریل تایم پی‌سی‌آر در آزمایشگاه‌ها

ریل تایم پی‌سی‌آر در زمینه‌های مختلف علوم پزشکی و تحقیقاتی کاربردهای گسترده‌ای دارد، از جمله:

•    تشخیص بیماری‌های عفونی:  شناسایی و تعیین مقدار ویروس‌ها، باکتری‌ها، قارچ‌ها و سایر عوامل بیماری‌زا در نمونه‌های بالینی. برای مثال ریل تایم پی‌سی‌آر به عنوان روش استاندارد برای تشخیص COVID-19  به کار گرفته شد.
•    تشخیص سرطان:  تعیین کمیت سلول‌های سرطانی، شناسایی جهش‌های ژنتیکی مرتبط با سرطان و پایش پاسخ به درمان.
•    ژنتیک:  تعیین میزان بیان ژن، شناسایی تغییرات ژنتیکی و مطالعه تنوع ژنتیکی.
•    تحقیقات دارویی:  ارزیابی اثربخشی داروها و مطالعه مکانیسم عمل آن‌ها.
•    کنترل کیفیت مواد غذایی:  شناسایی عوامل بیماری‌زا و موارد تقلب در مواد غذایی.

چطور ریل تایم پی‌سی‌آر کار می‌کند؟

در ریل تایم پی‌سی‌آر، از آغازگرها یا پرایمرهای اختصاصی برای تکثیر قطعه DNA مورد نظر و همچنین از مواد فلورسنت برای ردیابی میزان تکثیر آن استفاده می‌شود. این مواد فلورسنت می‌توانند به دو صورت عمل کنند:

•    رنگ‌های متصل بهDNA : این رنگ‌ها به DNA دو رشته‌ای متصل می‌شوند. با افزایش میزان DNA، میزان مواد فلورسانس آن‌ها نیز افزایش می‌یابد.

•    پروب‌های فلورسنت: این پروب‌ها توالی‌های اختصاصی در DNA هدف را شناسایی کرده و با تکثیر DNA، فلورسانس تولید می‌کنند.
با اندازه‌گیری میزان ماده فلورسانس در هر چرخه PCR، می‌توان میزان DNA اولیه در نمونه را به طور دقیق تعیین کرد.

مراحل اصلی Real-Time PCR

Real-Time PCR (qPCR)  همانند PCR معمولی است، با این تفاوت که در ریل تایم پی‌سی‌آر، تکثیر DNA به صورت همزمان با انجام واکنش اندازه‌گیری می‌شود. این فرایند شامل مراحل زیر است:

1.    تهیه نمونه:
o    ابتدا DNA یا RNA مورد نظر از نمونه‌ بیولوژیکی (مانند خون، بافت یا سلول) استخراج می‌شود.
o    اگر RNA به عنوان ماده‌ی اولیه استفاده شود، ابتدا باید توسط آنزیم reverse transcriptase به DNA مکمل (cDNA) تبدیل شود.
2.    تهیه مخلوط واکنش:
o    مخلوط واکنش شامل DNA الگو یا (cDNA)، پرایمرهای اختصاصی، DNA پلیمراز، نوکلئوتیدها و ماده‌ی فلورسنت)که برای ردیابی تکثیر DNA استفاده می‌شود( است.
3.    مراحل چرخه‌ایPCR :

o    مراحل زیر در یک دستگاه ترموسایکلر (thermal cycler) که قادر به اندازه‌گیری میزان ماده فلورسانس است، تکرار می‌شوند:
    )Denaturation واسازش DNA: (دو رشته‌ای در دمای بالا (حدود ۹۵ درجه سانتیگراد) به دو رشته‌ی تک تبدیل می‌شود.
    )Annealing اتصال: ( دما کاهش می‌یابد تا پرایمرها به توالی‌های مکمل خود در DNA تک رشته‌ای متصل شوند.
    Extension  )افزایش طول: ( DNA  DNA پلیمراز در دمای حدود ۷۲ درجه سانتیگراد رشته‌ی مکمل DNA را می‌سازد.
4.    تشخیص فلورسانس:
o    در طول مرحله‌ی افزایش طول یا در پایان آن، میزان فلورسانس توسط دستگاه اندازه‌گیری می‌شود.
o    افزایش میزان فلورسانس نشان‌دهنده‌ی افزایش میزان DNA تکثیر شده است.
5.    آنالیز داده‌ها:
o    در حین انجام واکنش منحنی‌هایی رسم می‌شوند که میزان فلورسانس را در برابر تعداد چرخه‌ها نشان می‌دهند. از این منحنی‌ها برای تعیین موارد زیر استفاده می‌شود:
    آستانه چرخه‌ای: (Ct) چرخه‌ای که در آن، میزان فلورسانس از یک مقدار آستانه فراتر می‌رود.
    مقدار اولیه DNA الگو
به طور خلاصه Real-Time PCR  به ما امکان می‌دهد تا نه تنها وجود یک قطعه‌ی DNA خاص را تشخیص دهیم، بلکه مقدار آن را نیز در نمونه‌ی اصلی اندازه‌گیری کنیم.

تفاوت مراحل PCR سنتی با ریل تایم پی‌سی‌آر

PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز) و Real-Time PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی) هر دو روش‌هایی برای تکثیر قطعات خاصی از DNA هستند، اما تفاوت‌های کلیدی در نحوه عملکرد و نوع اطلاعاتی که ارائه می‌دهند، وجود دارد. این تفاوت ها عبارتند از:

استفاده از پروب‌های فلورسانس در Real-Time PCR

استفاده از پروب فلورسانس در ریل تایم پی‌سی‌آر، تفاوت‌های اساسی و مهمی نسبت به PCR معمولی ایجاد می‌کند. پروب فلورسانس موجب تشخیص و اندازه‌گیری دقیق تر و اختصاصی تر، کاهش نتایج مثبت کاذب، امکان کمی سازی دقیق، افزایش حساسیت و همچنین امکان انجام واکنش های مالتیپلکس در ریل تایم PCR می‌شود.
به طور خلاصه استفاده از پروب فلورسنت در ریل تایم پی‌سی‌آر، این روش را به یک ابزار دقیق‌تر، حساس‌تر و اختصاصی‌تر برای تشخیص و اندازه‌گیری DNA نسبت به PCR معمولی تبدیل می‌کند.

اندازه‌گیری داده‌های در لحظه

اندازه‌گیری داده‌ها در لحظه، تفاوت‌های چشمگیری بین Real-Time PCR و PCR معمولی ایجاد می‌کند. این تفاوت‌ها عبارتند از: کمی سازی دقیق، حساسیت بالاتر، سرعت بیشتر، کاهش خطر آلودگی و تشخیص دقیق‌تر.
در حقیقت اندازه‌گیری داده‌ها در لحظه، Real-Time PCR را به روشی دقیق‌تر، حساس‌تر، سریع‌تر و ایمن‌تر نسبت به PCR معمولی تبدیل می‌کند.

کاربردهای ریل تایم پی‌سی‌آر در پزشکی و تحقیقات

ریل تایم پی‌سی‌آر کاربردهای گسترده و فراوانی در زمینه پزشکی و تحقیقات دارد. برخی از این کاربردها عبارتند از:

تشخیص ویروس‌ها با ریل تایم پی‌سی‌آر

ریل تایم پی‌سی‌آر به عنوان یک ابزار قدرتمند در تشخیص ویروس نقش اساسی ایفا می‌کند. این تکنیک با شناسایی و اندازه‌گیری دقیق میزان RNA یا DNA ویروسی در نمونه‌های بالینی، امکان تشخیص سریع و حساس عفونت‌های ویروسی را فراهم می‌سازد.  این تکنیک به ویژه در تشخیص زودهنگام بیماری‌های ویروسی، تعیین بار ویروسی (مقدار ویروس موجود در بدن بیمار) و پایش پاسخ به درمان‌های ضد ویروسی بسیار ارزشمند است. این روش به دلیل سرعت، دقت و حساسیت بالا، به طور گسترده در تشخیص ویروس‌هایی مانند HIV، هپاتیت، آنفولانزا و ویروس کرونا (COVID-19) مورد استفاده قرار می‌گیرد و نقش مهمی در مدیریت و کنترل بیماری‌های ویروسی ایفا می‌کند.

استفاده از PCR کمّی برای بررسی بیان ژن‌ها

ریل تایم پی‌سی‌آر به عنوان ابزاری کلیدی در مطالعه‌ی بیان ژن، امکان اندازه‌گیری دقیق و کمی میزان mRNA  تولید شده از ژن‌های خاص را فراهم می‌کند. در حقیقت ریل تایم پی‌‌سی‌آر امکان شبیه سازی ژن را فراهم می‌کند. این تکنیک به محققان کمک می‌کند تا تغییرات در سطح بیان ژن را در پاسخ به شرایط مختلف مانند بیماری، داروها یا تغییرات محیطی بررسی کنند. با استفاده از Real-Time PCR  می‌توان الگوهای پیچیده‌ی فعالیت ژن را در سلول‌ها و بافت‌ها شناسایی و نقش ژن‌های مختلف را در فرآیندهای بیولوژیکی و بیماری‌ها مشخص کرد. این اطلاعات برای توسعه‌ روش‌های درمانی جدید و درک بهتر مکانیسم‌های مولکولی بیماری‌ها بسیار ارزشمند است.

کاربرد ریل تایم پی‌سی‌آر در بیماری‌های ژنتیکی

ریل تایم پی‌سی‌آر (qPCR) کاربردهای متعددی در تشخیص بیماری های ژنتیکی دارد. برخی از این کاربردها عبارتند از:
•    تشخیص جهش های ژنتیکی qPCR: می تواند برای شناسایی جهش های خاص در DNA که باعث بیماری های ژنتیکی مانند فیبروز سیستیک، دیستروفی عضلانی دوشن و بیماری هانتینگتون می شوند، استفاده شود.
•    تشخیص حذف یا تکثیر ژن: برخی از بیماری های ژنتیکی ناشی از حذف یا تکثیر اشتباهی بخشی از DNA است qPCR. می تواند برای تشخیص این تغییرات در ژن ها استفاده شود.
•    تشخیص بیماری های ژنتیکی قبل از تولد:  پی‌سی‌آر کمی می تواند برای تشخیص بیماری های ژنتیکی در جنین نیز استفاده شود. این کار با استفاده از نمونه های DNA حاصل از آمنیوسنتز یا نمونه برداری از پرزهای کوریونی انجام می‌شود.
•    تشخیص ناقلین بیماری های ژنتیکی qPCR: می تواند برای شناسایی افرادی که ناقل یک ژن جهش یافته هستند اما خود به بیماری مبتلا نیستند، استفاده شود. این اطلاعات می تواند برای مشاوره ژنتیکی و تصمیم گیری در مورد فرزندآوری مفید باشد.
•    تعیین جنسیت qPCR: می تواند برای تعیین جنسیت جنین در مراحل اولیه بارداری استفاده شود. به ویژه در مواردی که خطر ابتلا به بیماری های ژنتیکی مرتبط با جنسیت وجود دارد.
•    تشخیص بیماری های ژنتیکی در نمونه های تومور: qPCR یا ریل تایم پی‌سی‌آر در شناسایی تغییرات ژنتیکی در سلول های تومور نیز کاربرد دارد. این کار می توانند به تشخیص و درمان سرطان کمک کند.
به طور خلاصه، qPCR یک ابزار قدرتمند برای تشخیص بیماری های ژنتیکی است که می تواند به شناسایی جهش ها، حذف یا تکثیر ژن ها، تشخیص بیماری ها قبل از تولد و تعیین وضعیت ناقلی کمک کند.

مزایای استفاده از ریل تایم پی‌سی‌آر

Real-Time PCR  نسبت به PCR معمولی مزایای متعددی دارد، از جمله:

دقت بالا در اندازه‌گیری

تعیین کمیت دقیق DNA یا RNA اولیه در نمونه.
سرعت و کارایی بیشتر نسبت به روش‌های دیگر
انجام واکنش و آنالیز نتایج در مدت زمان کوتاه.

توانایی تجزیه و تحلیل در زمان واقعی

قابلیت تجزیه و تحلیل در لحظه در Real-Time PCR مزایای قابل توجهی نسبت به PCR معمولی ایجاد می‌کند. از جمله این مزایا می‌توان به امکان کمیت سنجی دقیق، افزایش حساسیت، سرعت بیشتر و کاهش خطر آلودگی اشاره کرد. 

چگونه یک آزمایش ریل تایم پی‌سی‌آر را راه‌اندازی کنیم؟

راه‌اندازی یک آزمایش ریل تایم پی‌سی‌آر نیازمند دقت و توجه به جزئیات است. در اینجا مراحل کلی راه اندازی این آزمایش را توضیح می‌دهیم:

تجهیزات و مواد مورد نیاز

مواد و لوازم مورد نیاز برای راه‌اندازی آزمایش Real-Time PCR عبارتند از: 
•    DNA یا RNA الگو
•    پرایمرها
•    پروب‌ها 
•    DNA پلیمراز
•    نوکلئوتیدها (dNTPs)
•    بافر واکنش
•    کلرید منیزیم (MgCl2)
•    آب بدون نوکلئاز
•    دستگاه ریل تایم پی‌سی‌آر (ترمال سایکلر)
•    میکروتیوب مخصوص PCR
•    نوک سمپلر
•    سمپلر
•    رک میکروتیوب
•    دستکش

مراحل آماده‌سازی نمونه و واکنش PCR

1. طراحی پرایمر و پروب (یا انتخاب کیت آماده):
   •    پرایمرها:
   o    توالی‌های کوتاهی از DNA هستند که آغازگر تکثیر قطعه‌ی مورد نظر DNA هستند.
   o    طراحی پرایمرهای اختصاصی و کارآمد برای ریل تایم پی‌سی‌آر بسیار مهم است.
   •    پروب‌ها (در صورت استفاده):
   o    توالی‌های کوتاه‌تری هستند که به طور اختصاصی به قطعه‌ی DNA تکثیر شده متصل می‌شوند و سیگنال فلورسنت تولید می‌کنند.
   o    استفاده از پروب‌ها اختصاصیت و دقت واکنش را افزایش می‌دهد.
   •    کیت‌های آماده:
   o    برای بسیاری از کاربردهای رایج، کیت‌های آماده ریل تایم پی‌سی‌آر در دسترس هستند که حاوی پرایمرها، پروب‌ها و سایر اجزای ضروری هستند.
   .2 تهیه نمونه:
   •    استخراج DNA یا RNA از نمونه مورد نظر (بافت، خون، سلول و غیره)
   •    در صورت استفاده از RNA، ابتدا باید آن را به DNA) cDNA مکمل(  تبدیل کنید.
   •    کیفیت و خلوص DNA/cDNA استخراج شده برای به دست آوردن نتایج دقیق بسیار مهم است.
   . 3تهیه مخلوط واکنش:
   •    مخلوط واکنش باید حاوی اجزای زیر باشد:
   o    DNA الگو یا (cDNA)
   o    پرایمرهای رو به جلو و معکوس
   o    پروب (در صورت استفاده)
   o    DNA پلیمراز)معمولاً Taq پلیمراز(
   o    نوکلئوتیدها (dNTPs)
   o    بافر واکنش
   o    یون‌های منیزیم (MgCl2)
   o    آب بدون نوکلئاز
   غلظت مناسب هر یک از اجزا برای بهینه‌سازی واکنش ضروری است.
   .4  انجام واکنش ریل تایم پی‌سی‌آر:
   •    مخلوط واکنش را در دستگاه Real-Time PCR قرار دهید.
   •    برنامه حرارتی مناسب را تنظیم کنید:
   o    چرخه‌های تکراری شامل:
       واسرشت‌سازی (denaturation)
       اتصال (annealing)
       افزایش طول (extension)
   •    دستگاه، فلورسانس را در هر چرخه اندازه‌گیری می‌کند.
   .5  تجزیه و تحلیل داده‌ها:
   •    دستگاه ریل تایم پی‌سی‌آر منحنی‌های تکثیر را ایجاد می‌کند که نشان‌دهنده‌ی افزایش فلورسانس در طول زمان هستند.
   •    آستانه چرخه‌ای (Ct) برای هر نمونه تعیین می‌شود Ct. چرخه‌ای است که در آن سیگنال فلورسنت به طور قابل توجهی بالاتر از سطح پایه قرار می‌گیرد.
   •    از مقادیر Ct برای محاسبه مقدار اولیه DNA یا RNA در نمونه‌ها استفاده می‌شود.
   •    برای کمی‌سازی دقیق، معمولاً از یک منحنی استاندارد استفاده می‌شود.

نتیجه‌گیری: چرا ریل تایم پی‌سی‌آر یکی از مهم‌ترین تکنیک‌ها در آزمایشگاه‌های مولکولی است؟

ریل تایم پی‌سی‌آر به دلیل حساسیت، دقت و سرعت بالا، به یک تکنیک حیاتی در آزمایشگاه‌های مولکولی مدرن تبدیل شده است. همانطور که در مقاله بالا شرح دادیم این روش امکان تشخیص زودهنگام و دقیق بیماری‌های عفونی، تعیین کمیت بار ویروسی، شناسایی جهش‌های ژنتیکی، اندازه‌گیری دقیق بیان ژن و تشخیص سرطان را فراهم می‌کند. علاوه بر این، Real-Time PCR در تحقیقات دارویی، کنترل کیفیت مواد غذایی و کشاورزی نیز کاربرد گسترده‌ای دارد. توانایی این تکنیک در کمی‌سازی دقیق DNA و RNA، آن را به ابزاری ضروری برای پیشبرد دانش ما در زمینه‌های مختلف زیست‌شناسی و پزشکی تبدیل کرده است.
شرکت‌ دناژن با طراحی، ساخت و ارائه دستگاه‌ها و ابزارهای دقیق آزمایشگاهی، محققان و دانشمندان را در انجام آزمایش‌ها و پژوهش‌های پیچیده یاری می‌کند. دستگاه ریل تایم پی‌سی‌آر تولید شده در این شرکت با بالاترین کیفیت و قیمت مناسب در دسترس شما قرار گرفته است. برای اطلاع از قیمت این دستگاه و خرید آن کلیک نمایید.