اصول اولیه طراحی پرایمر
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) به‌عنوان یکی از مهم‌ترین و پرکاربردترین تکنیک‌ها در زیست‌مولکولی، پزشکی، ژنتیک و بیوتکنولوژی، به ابزارهایی نیاز دارد که دقت و اختصاصیت واکنش را تضمین کنند. در این میان، پرایمرها نقش حیاتی در تعیین ناحیه هدف DNA و آغاز فرآیند تکثیر دارند. طراحی صحیح پرایمر نه‌تنها موجب افزایش بازدهی PCR میشود، بلکه از بروز محصولات غیراختصاصی و تداخل‌های آزمایشی نیز جلوگیری میکند. به همین دلیل، شناخت دقیق اصول طراحی پرایمر برای هر پژوهشگر حوزه ژنتیک امری ضروری است.
از جمله مهم‌ترین پارامترهایی که باید هنگام طراحی پرایمر در نظر گرفته شود، می‌توان به طول مناسب پرایمر، دمای ذوب (Tm)، درصد GC، و پرهیز از ساختارهای ثانویه مانند دایمر و هیرپین اشاره کرد. به‌ویژه محاسبه دقیق Tm از اهمیت زیادی برخوردار است؛ زیرا تطابق دمایی بین دو پرایمر در یک جفت، عملکرد بهینه PCR را تضمین میکند. در این مقاله از دناژن تجهیز، ابتدا اصول پایه طراحی پرایمر معرفی شده و سپس چندین فرمول رایج برای محاسبه Tm با یکدیگر مقایسه خواهند شد تا دقیق‌ترین روش انتخاب و به بهینه‌سازی طراحی پرایمر کمک شود.
پرایمر چیست؟
در طراحی پرایمر هیچ DNA پلیمرازی قادر به ساختن DNA نیست و همه DNA پلیمرازها به یک انتهای OH ‘3 نیاز دارند تا بتوانند تکثیر را از روی DNA الگو انجام دهند. به همین دلیل برای تکثیر DNA چه در درون سلول و چه در محیط in vitro نیاز به پرایمر (primer است. در واقع پرایمر توالی کوتاهی از جنس DNA است که با ایجاد یک انتهای OH ‘3 جایگاهی برای فعالیت آنزیم DNA پلیمراز ایجاد میکند تا بتواند از رشته الگو سنتز را ادامه دهد. برای تکثیر یک قطعه نیاز به دو پرایمر است که Forward و Reverse نام دارند و با حروف اختصاری F و R نشان داده میشوند. اتصال پرایمرها به مولکول الگو بر پایه پیوندهای هیدروژنی استوار است. DNA دو رشته ایی است و ژن روی یکی از دو رشته قرار دارد. رشته‌ایی که توالی ژن روی آن قرار دارد رشته sense و رشته مقابل آن anti-sense نامیده میشود. پرایمر Forward برای رشته sense طراحی می شود. در مقابل، برای سنتز رشته Anti-sense پرایمر Reverse طراحی میشود. در واقع جهت انجام فرایند تکثیر DNA در دستگاه ترموسایکلر لازم است طراحی پرایمر به خوبی صورت گرفته باشد.
اهمیت طراحی دقیق پرایمر در موفقیت واکنش PCR
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یکی از قدرتمندترین و پرکاربردترین تکنیک‌ها در زیست‌مولکولی مدرن به‌شمار میرود. موفقیت این واکنش تا حد زیادی به کیفیت طراحی پرایمر بستگی دارد. پرایمرها، قطعات کوتاهی از DNA هستند که ناحیه هدف ژنومی را برای تکثیر مشخص میکنند. طراحی اصولی این توالی‌ها مستقیماً بر اختصاصیت، بازدهی و دقت PCR تأثیر می‌گذارد. انتخاب طول مناسب پرایمر، درصد GC متعادل، دمای ذوب بهینه، و جلوگیری از تشکیل ساختارهای ثانویه عواملی هستند که در طراحی پرایمر باید مورد توجه قرار گیرند. هرگونه سهل‌انگاری در این زمینه میتواند منجر به تکثیر نواحی غیراختصاصی، تولید محصولات ناخواسته، و در نهایت تفسیر نادرست نتایج شود. هدف این مقاله، بررسی اصول طراحی پرایمر، معرفی فرمول‌های محاسبه دمای ذوب (Tm)، مقایسه آنها و ارائه نکاتی کلیدی برای بهینه‌سازی طراحی پرایمر است. در ادامه، به بررسی اشتباهات رایج در طراحی پرایمر و تأثیر آنها بر نتیجه PCR نیز خواهیم پرداخت تا بستری علمی و کاربردی برای پژوهشگران فراهم شود.
بررسی طراحی پرایمر
در بررسی طراحی پرایمر باید به موارد زیر توجه نمایید:
1- محدود کردن تکثیر: برای اینکه یک قطعه خاصی از ژنوم را تکثیر کنیم با توجه به توالی DNA الگو پرایمر طراحی کرده و محل دقیق تکثیر را مشخص می‌کنیم. مثلا زمانی که هدف تکثیر یک ژن خاص است باید ابتدا و انتهای ژن را بدانیم و از قسمت ابتدا و انتهای ژن طراحی پرایمر انجام شود تا بتوان با استفاده از PCR این ژن را تکثیر کرد و آن را در موجود دیگری کلون کرد.
2- گاهی هدف اثبات وجود یا عدم وجود یک ژن در ارگانیسم است. برای این هدف نیازی نیست که حتما از ابتدا و انتهای ژن طراحی پرایمر انجام شود. می‌توان از قسمت‌های مختلف ژن پرایمری با کارایی و اختصاصیت بالا طراحی کرد که بسته به طول ژن می‌توان از وسط یا قسمت‌های دیگر ژن طراحی را انجام داد. ولی در مورد قبل که در بالا به آن اشاره شد حتما باید از ابتدا و انتهای ژن طراحی انجام شود.
3- پرایمرها برای نقشه‌یابی ژنوم نیز کاربرد دارند. برای نقشه یابی ژنوم از پرایمرهای تصادفی استفاده میشود.
ویژگی های طراحی پرایمر
پرایمرهای طراحی شده باید دو ویژگی اصلی و مهم را دارا باشند. کارایی پرایمر یا Efficiency پرایمر یک ویژگی است که نشان می‌دهد یک پرایمر تا چه حد در اتصال به ناحیه هدف و تکثیر قطعه مورد نظر و ایجاد محصول نهایی موفق بوده است. هر چه کارایی پرایمر بالاتر باشد، باند قوی‌تری در ژل الکتروفورز مشاهده خواهد شد.
ویژگی دوم اختصاصیت یا Specificity است که به این معنی است که پرایمر تنها به توالی مورد نظر متصل میشود و نه هیچ جای دیگری از DNA الگو. بنابراین برای پرایمرهای با اختصاصیت بالا، در الکتروفورز تنها یک باند مشاهده میشود. برای حفظ این دو ویژگی در طراحی پرایمر باید نکاتی را در حین طراحی رعایت کرد این نکات شامل: طول پرایمر، محتوای GC، GC Clamp، دمای Tm، دمای اتصال پرایمر به رشته الگو و طول قطعه تکثیری است که در ادامه توضیح داده خواهند شد.
مهم ترین موارد در طراحی پرایمر
در طراحی پرایمر برای واکنش PCR، رعایت مجموعه‌ای از اصول و فاکتورهای کلیدی الزامی است که تأثیر مستقیمی بر دقت، اختصاصیت، و بازدهی واکنش دارند. نخستین و مهم‌ترین پارامتر، طول پرایمر است؛ پرایمرهایی با طول ۱۸ تا ۲۴ نوکلئوتید، تعادل مناسبی بین اختصاصیت و پایداری اتصال ایجاد میکنند، در حالی‌که پرایمرهای کوتاه‌تر ممکن است به نواحی غیراختصاصی در ژنوم متصل شوند. دومین عامل، درصد GC است؛ مقدار بهینه بین ۴۰ تا ۶۰ درصد، باعث بهبود پایداری دو رشته DNA در حین واکنش میشود و دمای آنیلینگ را در محدوده مناسبی حفظ میکند. از سوی دیگر، رعایت الگوی GC Clamp در انتهای ′3 پرایمر با حضور ۱ یا ۲ نوکلئوتید G یا C، سبب بهبود اتصال آنزیم Taq پلیمراز و افزایش کارایی واکنش میشود.
عامل مهم بعدی، دمای ذوب (Tm) است که نشان‌دهنده دمای جدا شدن دو رشته DNA است و تحت تأثیر طول پرایمر، درصد GC و قدرت یونی محلول قرار دارد. روش‌های مختلفی برای محاسبه Tm وجود دارد که دقیق‌ترین آنها مدل Nearest Neighbor است. همچنین، دمای آنیلینگ (Ta)، که معمولاً ۲ تا ۵ درجه پایین‌تر از Tm در نظر گرفته میشود، نقش مهمی در جلوگیری از اتصال غیراختصاصی دارد. نهایتاً، طول قطعه تکثیری باید متناسب با هدف آزمایش انتخاب شود؛ معمولاً بین 100 تا 1000 جفت باز و برای Real-Time PCR کمتر از 200 جفت باز در نظر گرفته میشود.
در ادامه به مهم‌ترین نکات در طراحی پرایمر اشاره میشود.
1.طول پرایمر
به منظور تکثیر توالی DNA مد نظر محقق در دستگاه ترموسایکلر (دستگاه PCR) لازم است که طول بهینه‌ای از پرایمر طراحی شود. طول پرایمر فاکتوری است که بر اختصاصی بودن پرایمر تاثیر زیادی دارد. به‌طور کلی DNA از 4 نوع باز تشکیل شده است که طبق قانون احتمالات، احتمال حضور هر کدام از این نوکلئوتیدها برابر یک چهارم است. اگر توالی پرایمر مورد نظر از 10 نوکلئوتید تشکیل شده باشد احتمال وجود چنین توالی روی DNA الگو برابر با یک چهارم به توان 10 است. این بدین معناست که از هر یک میلیون باز، یک توالی مشابه توالی 10تایی پرایمر ما وجود دارد. ژنوم E. Coli حدود 6/4 میلیارد باز تشکیل شده است، پس احتمال وجود پرایمر 10 جفت بازی ما در این ژنوم برابر 6/4 است. به عبارت دیگر 6/4 بار احتمال دارد که پرایمر ما روی ژنوم تکرار شود. اگر طول پرایمر 20 نوکلئوتید شود این پرایمر از هر 50 میلیارد باز میتواند جایگاه خود را پیدا کند. در نتیجه با افزایش طول پرایمر اختصاصیت پرایمر بیشتر میشود. اختصاصیت پرایمر به عوامل دیگری نیز بستگی دارد که در ادامه به آن اشاره خواهد شد.
طول مناسب پرایمر برای ژنهای کاربردی bp 24 -18 است و در این بازه، افزایش هر نوکلئوتید، موجب تقویت ۴ برابری اختصاصیت پرایمر میشود. کاهش طول این رشته‌ها به شدت بر توانایی اتصال اختصاصی آنها اثرگذار خواهد بود، به طور‌یکه پرایمرهایی با طول کمتر از bp 15، عملا به هر نقطه از ژنوم متصل میشوند. در شرایط خاص پرایمر میتواند bp 45 – 40 طول داشته باشد. اما باید همواره به این نکته توجه داشته باشید که افزایش طول پرایمر، موجب بیشتر شدن دمای مرحله annealing و زمان آن خواهد شد و علاوه بر این، احتمال تشکیل ساختارهای ثانویه و پرایمر دایمرها را افزایش خواهد داد.
2- درصد GC
درصد GC در طول توالی پرایمر (GC Content)، درصد فراوانی نسبی نوکلئوتیدهای G و C را نشان می‌دهد که مقدار بهینه این پارامتر 55 – 45% است.
ولی محدوده رایج استفاده از این پارامتر بین 60 – 40% است. هرگز مجاز نیستیم این پارامتر را 80% یا 20% داشته باشیم زیرا دمای annealing مستقیما تحت تاثیر درصد GC است. برای طراحی پرایمر با نرم افزار، باید یک maximum و minimum تعیین شود. که مطابق آنچه در بالا گفته شد تعیین میشود. اگر درصد GC بیشتر از 60 باشد احتمالا پرایمر زمان جدا شدن از رشته الگو با مشکل مواجه میشود. اگر مقدار این پاراکتر از 40 کمتر باشد احتمالا پرایمر نتواند بخوبی به رشته الگو متصل شود.
3 GC Clamp-
نکته دیگری در در زمان طراحی پرایمر باید به آن توجه داشت پارامتر GC Clamp است که باید در انتهای ′3 پرایمر رعایت شود. Clamp به معنی گیره است. توصیه میشود که در 5 نوکلئوتید آخر به سمت ′3، یک یا دو نوکلئوتید را گوانین یا سیتوزین انتخاب کرد (شکل 1). سمت ′3 پرایمر سمتی است که Taq پلیمراز متصل میشود و هر چه اتصال سمت ′3 پرایمر محکم‌تر باشد DNA پلیمراز شانس بیشتری برای اتصال و شروع واکنش دارد. این پارامتر کارایی واکنش PCR را افزایش می‌دهد. نکته مهم دیگری که باید مد نظر قرار داد این است که تعداد G و C در 5 نوکلئوتید آخر سمت ′3 نباید بیشتر از دو عدد شود. زیرا زمینه را برای ایجاد مشکلاتی مانند تشکیل دیمرهای پایدار در سر ′3 فراهم خواهد کرد.
4- دمای ذوب پرایمر
مهم‌ترین نکته در طراحی پرایمر دقت به دمای Tm است که مخفف Theorical Melting point است. دمای ذوب پرایمر (Tm) به دمایی گفته میشود که در آن، نیمی از مولکول‌های دو رشته‌ای DNA (یا اتصال پرایمر به رشته مکمل) به دلیل شکسته شدن پیوندهای هیدروژنی، به حالت تک‌رشته‌ای درمی‌آیند.
این دما یکی از پارامترهای کلیدی در واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) محسوب میشود و انتخاب صحیح آن، نقش مهمی در افزایش دقت و کارایی فرآیند Annealing یا اتصال پرایمر به توالی هدف دارد. این دما به اختصار Tm نامیده شده و توسط نرم افزار محاسبه میشود.
سوال اینجاست که چه عواملی بر روی دمای Tm موثر هستند و ما چگونه می‌توانیم دمای Tm را دقیق محاسبه کنیم. اولین عاملی که روی دمای Tm تاثیر دارد GC content است که در بالا به آن اشاره شد. سیتوزین و گوانین دارای پیوندهای هیدروژنی سه‌گانه هستند. در مقابل، آدنین و تیمین تنها دو پیوند تشکیل می‌دهند. این تفاوت بر پایداری پرایمر تأثیرگذار است. هر چه درصد GC در پرایمر بیشتر باشد پرایمر با قدرت بیشتری به رشته الگو متصل میشود و انرژی بیشتری برای جدا کردن پرایمر نیاز است. انرژی بیشتر یعنی دمای بیشتر و در نتیجه دمای Tm پرایمر بالاتر میرود.
مورد بعدی که روی Tm پرایمر موثر است طول پرایمر است. هر چه پرایمر طولانی‌تر باشد میزان پایداری پیوند پرایمر با رشته الگو بیشتر میشود. پس دمای بالاتری برای جدا کردن آن نیاز است و در نتیجه دمای Tm پرایمر بالاتر میرود.
مورد آخری که بر روی دمای Tm تاثیر گذار است قدرت یونی بافر است. میدانیم که رشته DNA غنی از بار منفی است که توسط فسفات حمل میشود. دو بار همنام یکدیگر را دفع میکنند پس سوال اینجاست که چرا دو رشته DNA همدیگر را دفع نمی‌کنند و در سلول بسیار پایدار کنار همدیگر قرار می‌گیرند. در سلول پروتئین‌های هیستون وجود دارند که DNA را به دور خود می‌پیچند. هیستونها بار مثبت خیلی زیادی دارند که باعث میشود بار منفی DNA خنثی شود و پایداری DNA در سلول بالا رود. اما در واکنش PCR هیستونها وجود ندارند. پس به جای هیستونها، یون‌های مثبت را وارد واکنش PCR میکنند. این یون‌های مثبت می‌توانند از بار منفی DNA کم کنند و در نتیجه پایداری اتصال دو رشته را بالا ببرند. وقتی پایداری اتصال دو رشته بیشتر میشود دمای بالاتری برای جدا کردن دو رشه نیاز است در نتیجه دمای Tm پرایمرها هم بالاتر خواهد بود.
برای درک بیشتر قدرت یونی بافر به مثال زیر توجه کنید. فرض کنید دو محلول داریم که همه شرایط آنها یکسان است اما در محلول شماره 1 غلظت یون سدیم mM 100 و در محلول شماره 2 غلظت یون سدیم mM 50 است. قدرت یونی در محلولی که mM Na 100 وجود دارد بیشتر است. در نتیجه DNA در این محلول پایدارتر است. پس انرژی بیشتری برای اینکه پرایمر یا دو رشته DNA از هم جدا شوند نیاز است. در نتیجه Tm در محلول شماره 1 بیشتر است.
5-محاسبهTm
فرمول‌های زیادی برای محاسبه Tmارائه شده است که در اینجا چندتا از مهم‌ترین آنها اشاره خواهد شد. اولین فرمول مربوط به مارمر و دوتی (Marmer and Doty) است. یک فرمول سنتی برای محاسبه Tm است. در این فرمول به ازای هر نوکلئوتید گوانین و سیتوزین ˚C 4 و به ازای هر نوکلئوتید آدنین و تیمین ˚C 2 برای Tm پرایمر در نظر گرفته میشود که می‌توان با یک جمع جبری ساده مقدار آن را محاسبه کرد.
Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
مثال: توالی پرایمر 5′-CAATCGTACGGATCTAAG-3′ را در نظر بگیرید با توجه به فرمول بالا به صورت زیر محاسبه میشود:
Tm = 2(10) 4(8) = 52˚C
در این فرمول هیچ کدام از عوامل طول پرایمر و قدرت یونی در این فرمول دیده نمی‌شود. به همین دلیل این فرمول خیلی دقیق نیست. توصیه میشود از این فرمول برای پرایمرهایی با طول بیشتر از bp 14 استفاده نشود.
فرمول دیگر، معادله Wallace است که در این معادله علاوه بر نوع نوکلئوتیدها طول توالی هم برای محاسبه Tmدر نظر گرفته میشود.
اگر Tmهمان پرایمر قبلی با فرمول بالا محاسبه شود مقدار ˚C 76/45 بدست میآید. Tmمحاسبه شده در این روش با مقدار قبلی متفاوت است. قطعا با در نظر گرفتن طول پرایمر، این Tmبه میزان واقعی تر نزدیک خواهد بود. اما ایرادی که در این فرمول وجود دارد این است که مثل فرمول قبلی عوامل دیگر موثر بر Tmدر این فرمول محاسبه نشده است. به همین دلیل فرمول Howlley برای محاسبه دمای Tmمعرفی شد.
در این معادله نه تنها تعداد و نوع نوکلئوتیدها برای محاسبه در نظر گرفته میشود، بلکه قدرت یونی بافر نیز در این معادله گنجانده شده است. پس مقدار نمکی که در بافر وجود دارد را می‌توان لحاظ کرد. فرض کنید غلظت یون سدیم M 05/0 است. بر این اساس مقدار Tmمحاسبه شده ˚C 57/51 بدست میآید.
برای تخمین Tm در نرم افزارهای جدید برای پرایمرهای بلندتر، از تئوری ترمودینامیک نزدیک‌ترین همسایه (Nearest Neighbor Thermodynamic Theory) استفاده میشود که پیچیده‌تر از فرمول‌های بالاست و با استفاده از نرم‌افزارهای طراحی پرایمر، محاسبه میشود. این فرمول دقیق‌ترین فرمول برای محاسبه Tm است. بررسی دانشمندان نشان داد که یکی از عوامل موثر بر دمای لازم برای جدا کردن دو نوکلئوتید از هم، نوع نوکلئوتیدهای همسایه است. میزان انرژی جدا شدن دو نوکلئوتید را در حالت‌های مختلفی از نوکلئوتیدهای همسایه محاسبه کردند و جمع جبری این حالتها را بدست آوردند. عوامل دیگر مثل قدرت یونی مقدار پرایمر در محلول، مقدار منیزیم موجود در واکنش و غیره در محاسبات لحاظ کردند. این فرمول یک Tm دقیق از پرایمرها را ارائه می‌دهد. اگر با نرم افزارطراحی پرایمر Oligo 7 این Tm محاسبه شود مقدار ˚C 79/50 بدست میآید که بازهم با مقادیر محاسبه شده قبلی متفاوت است.
شواهد حاکی از آن است که معمولا، پرایمرهایی با Tm بین ˚C 52 تا 62 ، نتایج بهتری را در PCR نشان می‌دهند. دمای Tm نباید بیشتر از ˚C 65 باشد. دمای Tm از طول پرایمر و ترکیب بازی تبعیت میکند. هر چه درصد GC بیشتر باشد Tm هم بیشتر میشود. نکته بسیار مهم این است که اختلاف Tm دو پرایمر نباید بیشتر از ˚C 3 – 2 باشد.
5-دمای اتصال پرایمر به الگو
دمای اتصال پرایمر به الگو (Primer Annealing Temperature)که به اختصار Ta نامیده میشود و با Tm ارتباط دارد. اگر دمای Ta بیش از حد بالا باشد منجر به ایجاد محصول ضعیف در PCR میشود که بدان معناست که این پرایمرها ناکارآمد هستند. اگر دمای Ta بیش از حد پایین باشد باعث تولید محصولات غیر اختصاصی میشود. دمای Ta از فرمول زیر بدست میآید:
در این فرمول Tm پرایمر: دمای ذوب ناپایدارترین دوپلکس پرایمر- الگو و Tm محصول: دمای ذوب محصول PCR میباشد. همانطور که از این فرمول پیداست، دمای annealing، همواره پایین‌تر از دمای ذوب خواهد بود. در آزمایشگاه، معمولا دمای annealing، ˚C ۲ تا ۴، کمتر از دمای Tm در نظر گرفته میشود.
مقایسه فرمول‌های محاسبه دمای ذوب پرایمر (Tm) در طراحی پرایمر
در طراحی پرایمر برای واکنش PCR، محاسبه دقیق دمای ذوب (Tm) اهمیت زیادی دارد؛ چرا که این دما مستقیماً بر دمای Annealing و در نتیجه اختصاصیت و بازده واکنش تأثیر می‌گذارد. محققان مختلف فرمول‌هایی را برای تخمین Tm ارائه داده‌اند که در دقت، سادگی و پارامترهای مورد استفاده با هم تفاوت دارند. در جدول زیر، چهار فرمول معروف شامل Marmer & Doty، Wallace، Howley و Nearest Neighbor Thermodynamic از لحاظ طول پرایمر، درصد GC، در نظر گرفتن قدرت یونی و دمای محاسبه‌شده‌ی Tm با یکدیگر مقایسه شده‌اند.
| فرمول محاسبه Tm |
طول پرایمر (bp) |
درصد GC |
قدرت یونی لحاظ‌شده |
Tm (°C) |
| Marmer & Doty |
18 |
50% |
لحاظ نشده |
52 |
| Wallace |
18 |
50% |
لحاظ نشده |
45.76 |
| Howley |
18 |
50% |
0.05 M |
51.57 |
| Nearest Neighbor Thermodynamic |
18 |
50% |
دقیق |
50.79 |
در میان این روش‌ها، مدل ترمودینامیکی Nearest Neighbor دقیق‌ترین برآورد را ارائه می‌دهد، زیرا پارامترهای پیچیده‌تری از جمله ترکیب نوکلئوتیدهای همسایه، قدرت یونی، غلظت منیزیم و سایر عوامل موثر در واکنش را لحاظ میکند. به همین دلیل امروزه نرم‌افزارهای طراحی پرایمر عمدتاً بر اساس همین مدل فعالیت میکنند.
6-طول قطعه تکثیری
با طراحی یک جفت پرایمر forward و reverse اندازه قطعه تکثیری تعیین میشود. که بطور کلی طول قطعه تکثیری بین bp 1000 – 300 است. بهتر است که طول قطعه تکثیری از kb 3 بیشتر نباشد. پرایمرهایی که برای Real Time طراحی میشوند بهتر است طولی بین bp 150 – 50 تکثیر کنند. از پرایمرهایی که طول قطعه تکثیری آنها بیشتر از bp 400 است اجتناب شود.
مواردی که باید در طراحی پرایمر اجتناب کرد:
در طراحی پرایمر برای واکنش PCR، علاوه بر رعایت نکات مثبت، اجتناب از برخی اشتباهات نیز برای افزایش کارایی و اختصاصیت واکنش بسیار ضروری است. یکی از مهم‌ترین این موارد، جلوگیری از تشکیل ساختارهای ثانویه مانند سنجاق‌سری‌ها است. این ساختارها باعث میشوند پرایمرها به جای اتصال به توالی هدف، به یکدیگر یا به خودشان متصل شوند و در نتیجه پرایمر از دسترس DNA الگو خارج شده و واکنش PCR ناکارآمد شود.
همچنین، باید از طراحی پرایمرهایی که دارای توالی‌های مکمل در انتهای ۳’ هستند، خودداری شود؛ زیرا این ناحیه محل اتصال DNA پلیمراز است و در صورت تشکیل دایمر، این آنزیم قادر به انجام وظیفه نخواهد بود. از دیگر اشتباهات رایج، وجود تکرارهای طولانی از نوکلئوتیدهای G یا C در انتهای پرایمر است که میتواند موجب اتصال غیراختصاصی شود. همچنین نباید از پرایمرهای خیلی کوتاه (کمتر از ۱۸ باز) یا خیلی بلند (بیش از ۳۰ باز) استفاده کرد، چراکه یا اختصاصیت کافی ندارند یا ساختارهای ناپایدار و ناکارآمد ایجاد میکنند. رعایت این موارد از بروز نتایج نادرست، افزایش محصولات غیرهدف و کاهش بازدهی PCR جلوگیری میکند.
1- ساختارهای ثانویه (Secondary Structures)
ساختارهای ثانویه در اثر برهمکنش‌های بین مولکولی و درون مولکولی ایجاد میشوند و یک یا هر دو پرایمر را از دسترس آنزیم پلیمراز خارج میکنند. این مسئله موجب کاهش چشم گیر میزان محصول خواهد شد .اولین ساختار ثانویه احتمالی که برای پرایمر طراحی شده ممکن است تشکیل شود دایمر (dimer) است. دایمر یعنی اینکه پرایمرها بصورت تکمیل کننده هم طراحی می شوند (شکل 1) و به هم می چسبند که این موضوع اصلا برای PCR مطلوب نیست.
تشکیل دایمرها کیفیت PCR را پایین می‌آورد. این مورد را نرم افزارهای مختلف بررسی میکند و نرم افزار به شما می‌گوید که پرایمرهای طراحی شده دایمر تشکیل می‌دهند یانه. اگر دو پرایمر forward و Reverse تشکیل دایمر دهند cross dimer نامیده میشود.
این ساختارها در اثر برهم‌کنش بین دو پرایمر از یک نوع رخ می‌دهند. زمانی که دو پرایمر forward و یا دو پرایمر Reverseبه هم می‌چسبند self dimer ایجاد میشود. که self dimerهایی که در انتهای ′3 تشکیل میشوند بسیار خطرناک هستند.
همان طور که میدانیم، فراوانی پرایمرها در مخلوط واکنش، بسیار بیشتر از ژن هدف است. در این حالت، اگر مثلا پرایمر forward طوری طراحی شود که بخشی از توالی آن، مکمل بخش دیگر باشد، در مرحله annealing، به جای اتصال به مولکول الگو، به پرایمر همتای دیگر متصل خواهد شد و آنزیم نیز، رشته جدیدی را از روی آن سنتز خواهد کرد. نتیجه این امر، خارج شدن پرایمر از دسترس الگو است که به ضعیف شدن باند محصول در ژل الکتروفورز منجر میشود. در عوض، باندهای کوتاهی در پایین ژل الکتروفورز دیده میشوند که در نتیجه یک تکثیر اشتباهی ایجاد شده‌اند.
2-توالی‌های مکمل درون‌پرایمری یا بین پرایمرها
اگر درون یک پرایمر، بخش‌هایی وجود داشته باشد که مکمل یکدیگرند، ممکن است ساختارهای ثانویه‌ای مانند سنجاق‌سری (hairpin) تشکیل شود که از اتصال صحیح پرایمر به DNA هدف جلوگیری میکند. همچنین، اگر دو پرایمر (Forward و Reverse) مکمل یکدیگر باشند، ممکن است به‌جای اتصال به رشته‌ی هدف، به هم متصل شوند و دایمرهای پرایمری (primer-dimers) بسازند. این دایمرها منابع واکنش را مصرف میکنند و می‌توانند نتیجه‌ی PCR را به‌طور کامل مختل کنند.
3- شباهت زیاد بین پرایمرهای Forward و Reverse
اگر دو پرایمر دارای توالی‌های مشابه یا مکمل یکدیگر باشند، به‌ویژه در ناحیه‌ی ۳’، احتمال تشکیل دایمر پرایمر افزایش می‌یابد. این دایمرها در ژل الکتروفورز معمولاً به‌صورت باندهایی با اندازه بسیار کوچک ظاهر میشوند و منجر به کاهش کارایی و اختصاصیت PCR می‌گردند.
4-توالی‌های بسیار غنی از G یا C در انتهای ۳’ پرایمر
اگر چندین باز G یا C در انتهای ۳’ پرایمر قرار داشته باشند، ممکن است اتصال ناپایدار یا غیراختصاصی به نواحی غیرهدف در ژنوم ایجاد شود، چون G و C با سه پیوند هیدروژنی به هم متصل میشوند و پایداری بالاتری دارند. به همین دلیل توصیه میشود در طراحی، از کشیدگی‌های متوالی G یا C در انتهای پرایمر اجتناب شود، در عوض یک یا دو باز G/C در انتهای ۳’ برای اتصال مناسب کافی است.
5-طول بسیار زیاد یا بسیار کوتاه پرایمر
پرایمرهای بسیار کوتاه (کمتر از ۱۸ نوکلئوتید) معمولاً اختصاصیت کافی ندارند و ممکن است به نواحی متعددی از ژنوم متصل شوند. از طرفی، پرایمرهای خیلی بلند (بیشتر از ۳۰ نوکلئوتید) می‌توانند منجر به افزایش احتمال تشکیل ساختارهای ثانویه و کاهش بازدهی واکنش شوند. به‌طور معمول، طول ایده‌آل پرایمر بین ۱۸ تا ۲۵ نوکلئوتید است، که تعادلی بین اختصاصیت و دمای ذوب مناسب ایجاد میکند.
کلام آخر طراحی پرایمر
در مجموع، طراحی دقیق و علمی پرایمرها نقش بنیادینی در موفقیت واکنش PCR ایفا میکند. رعایت اصولی مانند انتخاب طول مناسب، تعادل در درصد GC، استفاده از دمای ذوب محاسبه‌شده با روش‌های معتبر، و پرهیز از ساختارهای ثانویه، همگی به افزایش دقت، اختصاصیت و بازدهی واکنش کمک میکنند. همچنین، آشنایی با فرمول‌های مختلف محاسبه دمای Tm و مقایسه آنها امکان انتخاب بهینه‌ترین شرایط را برای هر نوع آزمایش فراهم می‌سازد. با درنظر گرفتن این عوامل، می‌توان از بروز خطاهای رایج جلوگیری کرد و نتایج قابل اعتمادتر و تکرارپذیرتری در مطالعات مولکولی به‌دست آورد. در نهایت، طراحی پرایمر نه‌تنها یک مهارت فنی، بلکه یک عنصر راهبردی در موفقیت پروژه‌های تحقیقاتی و تشخیصی محسوب میشود.
با ما تماس بگیرید