Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР) __ это техника,широкр применяемая в медицине и исследовниях молекулярной биологии для получения многочисленных копий определенного участка ДНК,такого как конкретный ген.ПЦР используется для различных целей,включая подготовку ДНК для секвенирования и создание судеьбных ДНК-профилей из минимального количества образцов.эТа методика также помогает выявлять патогены при инфекциях,определяя наличие или отсутствие конкретных генов.Например,во время пандемии COVID-19 ПЦР-Тесты определяли,содержал ли образцов мазка человека фрагмент генетического материала вируса, что давало положительный или отрицательный результат.
Метод ПЦР был разработан американским биохимиком Кэри Маллисом в 1983 году во время его работы в компании Cetus Corporation.он используется для быстрого увеличения количества копий конкретного образца ДНК,что позволяет ученым подробно изучать полученный материл.эта техника играет ключевую роль в различных методах генетического тестирования и исследований,включая анализ древних образцов ДНК и выявление инфекционных организмов.ПЦР включает серии темпкратурных циклов,которые экспоненцальное увеличивают даже минимальные количества ДНК.Применение этого метода охватывает множество областей,таких как биологические исследования и криминалистическаф экспертизма,что делает ПЦР частым инструментом в медицинских лабораторных исследованиях.
ПЦР является нзамениным методом для генетического тестирования и анализа, включая идентификацию инфекционных организмов и оценку возраста образца ДНК. Проходя через несколько циклов изменения температурных условий, ПЦР обеспечивает экспоненциальное увеличение очень малых последовательностей ДНК. Его использование в медицинских лабораторных исследованиях стало все более распространенным и важным для таких целей, как биомедицинские исследования и судебная экспертиза.
Термическое циклирование, являющееся ключевым элементом большинства методов ПЦР, включает температурно-зависимые процессы, такие как плавление ДНК и ферментативная репликация ДНК. Эти процессы обеспечивают эффективную амплификацию ДНК-последовательностей, защищая реагенты во время циклирования.
Фермент Taq-полимераза, полученный из термофильных бактерий Thermus aquaticus, используется практически во всех приложениях ПЦР. Taq-полимераза устойчива к высоким температурам, необходимым для денатурации ДНК во время ПЦР, что предотвращает ее разрушение. До появления Taq-полимеразы ДНК-полимераза должна была добавляться вручную на каждом цикле, что было трудоемким и дорогостоящим процессом.
ПЦР состоит из нескольких ключевых компонентов:
• Шаблон ДНК: Исходный материал, представляющий собой ДНК из исследуемого образца.
• ДНК-полимераза: Taq-полимераза часто используется, так как она термоустойчива и сохраняет активность при высоких температурах, не денатурируя.
• Олигонуклеотидные праймеры: Короткие одноцепочечные последовательности ДНК, комплементарные к смысловой и антисмысловой цепям целевой ДНК, которые служат начальной точкой для синтеза ДНК.
• Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ): Это строительные блоки для синтеза ДНК, которые обеспечивают стабильность во время полимеризации. Они представляют собой непарные основания.
•Буферная система: Присутствие магния и калия в буфере улучшает процессы денатурации и ренатурации ДНК, а также повышает активность и стабильность полимеразы.
ПЦР может выполняться в различных форматах:
•Реальная ПЦР (Real-time PCR): Эта техника использует флуоресцентный зонд для мониторинга амплификации ДНК в реальном времени. Интенсивность флуоресцентного сигнала напрямую коррелирует с количеством амплифицированных молекул ДНК.
•Нестед-ПЦР (Nested PCR): Этот метод направлен на повышение специфичности и чувствительности за счет использования дополнительных наборов праймеров. Путем нацеливания на разные участки ДНК он снижает неспецифическое связывание нежелательных фрагментов.
•Мультиплексная ПЦР (Multi-step PCR): Этот подход позволяет амплифицировать несколько целевых последовательностей ДНК в одном эксперименте. Он обеспечивает одновременную амплификацию различных ДНК-мишеней.
•Количественная ПЦР (Quantitative PCR): Этот метод использует линейную амплификацию ДНК для идентификации, характеристики и количественного определения конкретной цели в образце.
ПЦР обладает рядом преимуществ. Она проста в использовании и понимании, работает с высокой скоростью. ПЦР позволяет получить миллионы или даже миллиарды копий определенного продукта с использованием высокочувствительного подхода для секвенирования, клонирования и анализа. QRT-ПЦР (количественная ПЦР в реальном времени) обладает всеми преимуществами ПЦР, но дополнительно предоставляет возможность количественного анализа результатов. Благодаря этому она применяется в изучении изменений уровня экспрессии генов в опухолях, бактериях и других болезненных состояниях.
ПЦР является мощным и ценным инструментом иследований.Она используется для определения последовательностей заболеваний с неизвестной этиологией,что позволяет не только прояснить суть самих заболеваний,но и обнаружить ранее неизвестные вирусы,связаннве с известными патогенами.если процесс будет еще больше упрощен и будут разработаны чувствительные нерентгенологические методы обнаружения, ПЦР продолжит занимать важное место в клинических лабораториях на долгие годы.
ПЦР сталкивается с вызовами при расчете областей ДНК в процессе денатурации, амплификации и репликации.
Использование специфических праймеров ДНК позволяет точно идентифицировать целевые бактерии. В области молекулярной биологии ПЦР стала доминирующей техникой, способствующей идентификации генов и обнаружению мутаций, что значительно расширяет возможности исследователей.
Она превратилась в метод для идентификации микробных патогенов с минимальным количеством образцов для исследования. В настоящее время ПЦР в основном используется для подтверждающих исследований при диагностике герпетического кератита.
Процедура ПЦР занимает примерно 4-8 часов, что на три часа меньше, чем традиционные методы.
Мультиплексная ПЦР, особый тип ПЦР, позволяет амплифицировать несколько целевых последовательностей ДНК одновременно. Она получила признание как "золотой стандарт" для диагностики метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA) благодаря своей способности обнаруживать различные гены антибиотикорезистентности, продуцируемые MRSA.
ПЦР имеет несколько значительных ограничений.Одним из главных недостатков является необходимость предварительного изучения целевой последовательности для разработки специфических праймеров, которые обеспечат селективную амплификацию.Пользователи ПЦР должны точно знать последовательности,расположенные вверх по течению от целевого региона на обоих одноцепочечных шаблонах,чтобы обеспечить правильное связывание ДНК-прлимеразы с гибридами праймера и шаблона и успешную амплификацию всей целевой области во время синтеза ДНК.
Как и другие ферменты, ДНК-полимеразы могут вносить ошибки, что приводит к мутациям в полученных фрагментах ПЦР. Еще одним недостатком является возможность ложноположительных или неокончательных результатов, даже при наличии минимальных количеств контаминированной ДНК. Чтобы минимизировать риск контаминации, приготовление реагентов, подготовка ПЦР и анализ результатов должны проводиться в отдельных помещениях. Рекомендуется использовать одноразовые аликвоты реагентов, пипеторы с удлиненными наконечниками и одноразовыми поршнями. Также важно следовать однонаправленному рабочему процессу в лаборатории и тщательно очищать все материалы и реагенты перед их использованием в комнате для подготовки ПЦР.
• ПЦР имеет определенные ограничения, такие как меньшая специфичность по сравнению с культивированием и окрашиванием, что увеличивает вероятность ложноположительных результатов. Сложный дизайн праймеров и необходимость учитывать несколько возможных микробов до выполнения сложных процедур создают проблемы для врачей.
• Праймеры, используемые для инфекционного кератита, такие как праймеры бактериальной ДНК 16S и праймеры грибковой ДНК 18S, хорошо известны. Однако из-за сходства между различными бактериями и грибами существует риск амплификации общей ДНК, что может привести к ложноположительным результатам при обнаружении нормальной флоры из внешней среды роговицы.
• В одном случае несвязанные микробы были обнаружены в контрольных образцах ПЦР, возможно, из-за воздушной контаминации при транспортировке образцов из Индии. Хотя воздушная контаминация редко встречается в ПЦР, она может быть более распространена в случаях кератита или считаться исключительным случаем.
• Перекрестная контаминация является проблемой как при культивировании, так и при окрашивании, однако чувствительность ПЦР увеличивает этот риск. Разные географические регионы могут содержать разные микробные популяции.
• В ходе десятилетнего исследования было установлено, что кератит, связанный с MRSA, был более тяжелым в определенном регионе по сравнению с другими провинциями, что позволяет предположить, что клиницисты должны учитывать региональные факторы при запросе и интерпретации результатов ПЦР.
• Несмотря на высокую эффективность ДНК-полимераз, они не безупречны. Они могут вносить ошибки как в человеческом организме, так и во время ПЦР. Например, Taq-полимераза, часто используемая в ПЦР, не обладает активностью 3'до 5' экзонуклеазы, что препятствует исправлению неправильно включенных нуклеотидов, как это происходит у высших эукариот.
Технология ПЦР играет ключевую роль в исследованиях метабаркодинга,но результвты существенно отличаются от традиционных методов отбора проб,не основанных на ПЦР.это проводит к нескольким важным выводам. Во-первых, нет прямой зависимости или одно-одного соответствия между числом назначенных чтений в исследовании eDNA (экологическая ДНК) и количеством организмов-источников. Во-вторых, нельзя последовательно ожидать высокой корреляции в оценках богатства таксонов между eDNA и традиционными методами. Даже незначительные корректировки лабораторных процедур могут привести к значительным расхождениям в результатах.
Несмотря на эти проблемы,исследования метабаркодинга оказались весьма полезными.Они позволяют обнаруживать сотни или тысячи таксонов в каждой пробе и способсвуют идентификации биологических сообществ в различных средах и местах отбора проб.однако для того,чтобы eDNA стала обычным источником данных в экологических исследованиях, крайне важно понять механизмы, связывающие чтения ампликонов с биомассой или численностью видов. Это понимание необходимо для таких приложений, как оценка запасов рыбы или обследования популяций редких видов, где требуется количественная оценка организмов.
Сосредоточив внимание на генерации данных метабаркодинга,мы получили представление о том,каким образом эти данные могут быть сопоставлены с другими методами обследования, а также о том, где это невозможно.это предоставило количественный механизм для мониторинга изменений в экологических образцах.
021-66840435
Менеджер по Продажам Отдела России и СНГ
+989101638848
Связаться с нами
