Гель-электрофорез — это метод, используемый для разделения фрагментов ДНК (или других крупных молекул, таких как РНК и Белки) с учетом их размера и заряда. Процесс включает пропускание электрического тока через гель, содержащий анализируемые молекулы. Из-за различий в размере и заряде молекулы мигрируют через гель в различных направлениях или с разной скоростью, что способствует их разделению.
Соотношение заряда и массы всех молекул ДНК одинаковое, что приводит к разделению фрагментов ДНК исключительно по их размеру во время гель-электрофореза.используя электрофорез,мы можем наблюдать количество отдельных фрагментов ДНК в образце и сравнивать их относительные размеры. Кроме того, можно определить точный размер сегмента ДНК, сравнив его со стандартным "критерием", состоящим из фрагментов ДНК с установленными размерами.
Установка для гель-электрофореза состоит из геля, обычно из агара или полиакриламида, и электрофоретической камеры, которая часто представляет собой жесткую пластиковую коробку или резервуар. На одном конце камеры расположен катод, в качестве отрицательного контакта, в то время как анод, выполняющий функцию положительного контакта, расположен на противоположном конце. Гель содержит серию лунок, расположенных близко к катоду. Гель аккуратно помещается в камеру и покрывается буферным раствором. С помощью пипетки образцы загружаются в лунки.
Для начала процесса, камера подключается к источнику питания, который, при активации, создает электрическое поле в буфере. Это электрическое поле вызывает миграцию молекул с отрицательным зарядом, таких как ДНК и РНК (белки требуют обработки детергентом, чтобы получить отрицательный заряд), через гель к аноду. Движение этих молекул определяется пористой матрицей геля, в результате чего более крупные и тяжелые молекулы мигрируют медленнее по сравнению с более мелкими и легкими молекулами. Плотность пор в геле и сам материал геля также влияют на скорость миграции молекул.
В многих случаях вместе с экспериментальными образцами запускается окрашенная "лестница" или маркер, содержащий молекулы с известными молекулярными массами, служащий эталоном для определения размера. Маркер визуально отслеживается по мере его движения через гель, что облегчает наличие красителя. Экспериментальные образцы также обычно окрашиваются для улучшения их видимости. Одним из часто используемых красителей для ДНК является этидий бромид, который светится при ультрафиолетовом освещении, что облегчает четкое визуализирование процесса гель-электрофореза.
Как следует из названия, при гель-электрофорезе используется гелеобразное вещество, известное как гель. Гели, используемые для разделения ДНК, обычно состоят из агарозы, полисахарида. Агароза обычно поступает в виде сухих порошкообразных хлопьев. Для создания геля агароза нагревается в буферном растворе, содержащем воду и соли. При охлаждении агароза затвердевает, образуя слегка мягкую гелевую структуру. На молекулярном уровне гель состоит из матрицы, образованной молекулами агарозы, соединенными водородными связями, что приводит к формированию небольших пор. На одном конце геля находятся углубления, напоминающие лунки, в которые помещаются образцы ДНК.
Для подготовки к добавлению образцов ДНК гель необходимо вставить в Гель-Бокс. Гель-Бокс состоит из двух концов:один из которых подсоединен к положительному электроду,а другой к отрицательному.Центральная часть бокса, где размещен гель, заполняется буферным раствором, содержащим соли, которые способствуют проводимости электрического тока. Хотя на приведенном изображении это не видно (из-за моих не самых лучших художественных навыков), буферный раствор заполняет гель-бокс до уровня, при котором он лишь слегка покрывает гель. Конец геля с лунками ориентирован в сторону отрицательного электрода, а противоположный конец, куда будут мигрировать фрагменты ДНК, направлен в сторону положительного электрода.
Гель-электрофорез использует гель, который можно описать как твердое, желеобразное вещество, напоминающее желе. В контексте разделения ДНК для создания геля обычно используется агароза, полисахарид. Агароза изначально находится в виде сухих порошкообразных хлопьев, которые затем смешиваются с буферным раствором (вода с солями) и нагреваются. При охлаждении агароза затвердевает, образуя слегка мягкий гель. На молекулярном уровне гель состоит из сети молекул агарозы, соединенных водородными связями, что приводит к формированию небольших пор. Гель имеет лунки — карманоподобные углубления, расположенные на одном конце, в которые помещаются образцы ДНК для анализа.
Для подготовки геля к нанесению образцов ДНК его необходимо вставить в гель-бокс. Гель-бокс состоит из двух концов: один конец подключен к положительному электроду, а другой — к отрицательному электроду. В основное тело бокса заливается проводящий буферный раствор, содержащий соли, который обеспечивает протекание электрического тока. Хотя на изображении это может быть не очень четко видно (из-за моих выдающихся художественных способностей), буферный раствор аккуратно добавляется в гель-бокс до тех пор, пока он слегка не покроет гель. Важно отметить, что конец геля с лунками ориентирован в сторону отрицательного электрода, а противоположный конец, куда будут мигрировать фрагменты ДНК, направлен в сторону положительного электрода.
После размещения геля в гель-боксе мы аккуратно вводим каждый из ДНК-образцов, которые хотим проанализировать (например, ПЦР-продукты или плазмиды, подвергшиеся рестрикционному расщеплению), в отдельные лунки. Кроме того, одна из лунок специально предназначена для ДНК-маркера, который служит эталоном, содержащим фрагменты ДНК известных длин. Желательно выбрать коммерческий ДНК-маркер, который охватывает ожидаемый размерный диапазон наших фрагментов.
Затем включается источник питания гель-бокса, что инициирует прохождение электрического тока через гель. Из-за наличия отрицательно заряженных фосфатных групп в сахарофосфатном остове молекул ДНК они начинают мигрировать через матрицу геля к положительному электроду. Это движение происходит при включении питания, и процесс часто называют «пробегом» геля, так как через него проходит ток.
Во время пробега геля фрагменты ДНК с меньшей длиной движутся быстрее через поры в матрице геля по сравнению с более длинными фрагментами. По мере того как время проходит и гель продолжает пробег, самые короткие фрагменты ДНК приближаются к положительному концу геля, в то время как самые длинные остаются ближе к лункам. Стоит отметить, что очень короткие фрагменты ДНК могут мигрировать за пределы геля, если процесс пробега продолжался слишком долго.
Для визуализации разделенных фрагментов ДНК можно проанализировать гель и наблюдать полосы различных размеров на его поверхности. Обрабатывая гель красителем, связывающимся с ДНК, и подвергая его воздействию ультрафиолетового (УФ) света, фрагменты ДНК начинают светиться, что позволяет визуально определить наличие ДНК на разных позициях вдоль длины геля.
Отдельный участок ДНК, который проявляется как четко определенная метка на геле, называется полосой. В каждой полосе находятся многочисленные фрагменты ДНК одинакового размера, которые коллективно мигрировали в одно и то же место. Важно отметить, что одиночный фрагмент ДНК или небольшая группа фрагментов не будут видны на геле по отдельности.
Сравнивая полосы, наблюдаемые в образце, с ДНК-маркером, можно приблизительно оценить их размеры. Например, наиболее заметная полоса на изображенном выше геле имеет длину приблизительно X пар оснований (п.н.).
Горизонтальный гель-электрофорез — это метод, который использует основные принципы разделения молекул ДНК, РНК или белков на основе их молекулярного размера и заряда. В этом методе гель располагается горизонтально и погружается в непрерывный буфер. Для разделения гель-бокса на две части используется агарозный гель. На одном конце гель-бокса находится анод, а на другом — катод. При подаче электрического тока буфер создает градиент заряда. Однако при нагрузке гель нагревается.
Буфер также выполняет функцию охлаждающей жидкости, поддерживая температуру на оптимальном уровне. За счет рециркуляции рабочего буфера предотвращается образование градиента pH. Горизонтальный гель-электрофорез не может использовать систему дискретного буфера, так как два отсека системы геля соединены с рабочим буфером.
В горизонтальном гель-электрофорезе нельзя использовать акриламид, потому что гель-бокс подвергается воздействию кислорода. Присутствие кислорода препятствует полимеризации акриламида, что затрудняет образование геля. Горизонтальный гель-электрофорез — это простой метод, широко используемый для разделения ДНК и РНК.
Вертикальный гель-электрофорез основан на тех же фундаментальных принципах, что и гель-электрофорез, но считается более сложным по сравнению с горизонтальным методом. В этом методе используется не непрерывный буфер. Верхняя камера содержит катод, а нижняя камера — анод. Электроды в каждом отсеке создают необходимое электрическое поле. Тонкий слой геля заливается между двумя стеклянными пластинами, при этом верхняя часть геля погружается в верхнюю камеру, а нижняя — в нижнюю. При подаче электрического тока небольшая часть буфера перемещается из верхней камеры в нижнюю через гель.
В вертикальном гель-электрофорезе буфер течет только через гель, что позволяет точно контролировать градиент напряжения во время процесса разделения. В этом методе можно использовать акриламидный гель, поскольку отсеки не подвергаются воздействию атмосферного кислорода. Меньший размер пор акриламидного геля обеспечивает точное разделение с высокой разрешающей способностью.
021-66840435
Менеджер по Продажам Отдела России и СНГ
+989101638848
Связаться с нами
