Вестерн-блоттинг, также известный как иммуно-блоттинг, представляет собой метод, используемый для анализа отдельных белков в смеси белков, например, в лизате клеток. При вестерн-блоттинге (иммуно-блоттинге) белковая смесь подвергается гель-электрофорезу в носителе (SDS-PAGE, native PAGE, изоэлектрическое фокусирование, 2D гель-электрофорез и др.) для разделения белков на основе их размера, заряда или других различий в отдельных белковых полосах. Разделенные белковые полосы затем переносятся на носитель, такой как нитроцеллюлоза, нейлон или PVDF, этот процесс называется блоттингом. Белки прикрепляются к мембране в том же порядке, как они были разделены из-за зарядовых взаимодействий. Белки на иммуно-блоте затем становятся доступными для связывания с антителами для их обнаружения.
Вестерн-блоттинг является широко используемым исследовательским методом, который позволяет разделять и идентифицировать специфические белки в сложной смеси. Этот метод позволяет определить относительные уровни белка между образцами и установить молекулярную массу целевого белка, предоставляя информацию о его посттрансляционной обработке. Для достижения этого вестерн-блот включает три этапа: (1) разделение белков по размеру, (2) перенос их на Твердую опору и (3) визуализация целевого белка с использованием первичных и вторичных антител.
Несмотря на свою общую простоту, вестерн-блоттинг является чрезвычайно мощным методом, поскольку он предоставляет дополнительную информацию, которую трудно получить с помощью других базовых иммунологических лабораторных методов. Путем разделения белков по размеру во время гель-электрофореза и последующего их обнаружения с помощью специфически направленного антитела, процедура фактически подтверждает идентичность целевого белка.
Вестерн-Блоттинг включает шесть этапов:подготовка образцов, гель-электрофорез, перенос белков, блокирование, инкубация с антителами и обнаружение и визуализация белков.
1. Подготовка образцов: Белки извлекаются из различных источников, таких как ткани или клетки. Образцы тканей разрушаются с помощью механических методов, таких как гомогенизация или сонкация. Для предотвращения деградации образца при низких температурах добавляются ингибиторы протеаз и фосфатаз. Концентрация белка определяется с помощью спектрофотометра, чтобы загрузить в каждую лунку подходящее количество белков.
2. Гель-электрофорез: Он проводится с использованием полиакриламидных гелей (PAG), загруженных додецилсульфатом натрия (SDS). Используются два типа геля: концентрирующий гель, который собирает все белки в одну полосу, и разделяющий гель, который разделяет белки по молекулярной массе. Меньшие белки мигрируют быстрее в SDS-PAGE при приложенном напряжении. Размер пор геля определяет диапазон разделения белков, который обычно составляет от 5 до 2000 кДа.
3. Перенос белков: Включает перемещение разделенных белков с геля на твердую опорную мембрану, делая их доступными для обнаружения антителами. Основным методом является электроблоттинг, при котором электрическое поле перпендикулярно поверхности геля используется для втягивания белков в мембрану. Это можно делать в полусухих или влажных условиях, причем влажные условия являются более надежными.
4.Блокирование: Это важный этап, предотвращающий неспецифическое связывание антител с мембраной. Обычно используются блокаторы, такие как BSA и обезжиренное сухое молоко. Мембрану помещают в разведенный белковый раствор, позволяя белкам прикрепляться к нетаргетным участкам на мембране и снижать фоновый шум в конечных результатах вестерн-блоттинга.
5. Инкубация с антителами: Включает связывание первичных антител с целевым белком. Выбор первичных антител зависит от конкретного антигена, который необходимо обнаружить. Промывание мембраны раствором антител помогает минимизировать фон и удалить несвязанные антитела. Затем мембрану обрабатывают специфическим вторичным антителом, конъюгированным с ферментом, которое связывается с первичным антителом, реагировавшим с целевыми белками. Соответствующее вторичное антитело выбирается на основе вида, из которого получено первичное антитело.
6.Обнаружение и визуализация белков: Достигается с помощью субстрата, который реагирует с ферментом, связанным со вторичным антителом, создавая окрашенное вещество. Это позволяет определить денситометрические показатели и расположение целевого белка. Белковые полосы сравниваются с маркером для приближенного определения размера. Доступны различные системы обнаружения, включая колориметрические, хемилюминесцентные, радиоактивные и флуоресцентные методы.
Выбор правильных антител для вестерн-блоттинга зависит от качества антител и экспериментальных условий, в которых они используются. Чтобы достичь высокой чувствительности и специфичности, важно учитывать следующие факторы:
1. Вид антитела: Когда вы работаете с образцами, содержащими эндогенные иммуноглобулины, такими как лизаты тканей или супернатанты клеточных культур, содержащие сыворотку, рекомендуется выбирать первичное антитело, полученное от вида, отличного от вида вашего образца. Например, если вы исследуете белок мыши, выберите первичное антитело, полученное от другого вида, например, кролика. Это помогает предотвратить перекрестную реактивность между вторичным антителом против иммуноглобулинов и эндогенными иммуноглобулинами, присутствующими в образце. Однако при работе с образцами, не содержащими эндогенные иммуноглобулины, выбор вида, от которого получено первичное антитело, менее критичен.
2.Наличие валидации KO (knockout): Если возможно, рекомендуется выбирать первичное антитело, прошедшее валидацию на модели с нокаутом (KO). Это гарантирует, что антитело специфически связывается с предполагаемой целью.
3.Вторичное антитело: Чтобы визуализировать ваш целевой белок, выберите вторичное антитело, которое связывается с видом-хозяином первичного антитела. Вторичные антитела с ферментной меткой, такие как антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) или щелочной фосфатазой (AP), или флуоресцентные конъюгаты, оптимизированные для вестерн-блоттинга, обеспечивают высокий уровень чувствительности. Важно убедиться, что длина волны излучаемого света конъюгата совместима с вашим устройством для считывания или сканером.
4.Усиление сигнала: Использование вторичных антител в вестерн-блоттинге предпочтительно благодаря их увеличенной чувствительности по сравнению с использованием только первичных антител. Вторичные антитела связываются с несколькими участками на первичном антителе, усиливая сигнал. Это усиление сигнала облегчает обнаружение целевого белка в сложной смеси белков.
5.Прямые конъюгаты первичных антител: В некоторых случаях использование прямых конъюгатов первичных антител, таких как HRP-конъюгаты, может ускорить и упростить протокол вестерн-блоттинга, исключив необходимость в этапе с вторичным антителом. При выборе конъюгатов первичных антител важно обеспечить их специфичность. Рекомбинантные моноклональные антитела предпочтительнее, так как они обеспечивают высокую специфичность и стабильную производительность в различных партиях.
Тем не менее, следует отметить, что, в отличие от вторичных антител, прямые конъюгаты первичных антител не обеспечивают усиления сигнала. Поэтому целевой белок должен быть в достаточном количестве в образце для эффективного обнаружения. Компания Abcam предлагает широкий ассортимент рекомбинантных первичных антител, напрямую конъюгированных с HRP, которые подходят для анализа вестерн-блоттинга. Если нужное вам антитело не доступно в подходящем конъюгированном формате, вы можете использовать наборы для конъюгации антител от Abcam.
Техника вестерн-блоттинга находит широкое применение в различных научных областях. Основное ее назначение — это оценка присутствия или отсутствия, размера и количества целевых белков в образце. Эта информация важна по многим научным причинам. Ниже приведены некоторые конкретные примеры применения метода вестерн-блоттинга:
1.Взаимодействие белков с ДНК: Вестерн-блоттинг может использоваться для изучения взаимодействия белков с молекулами ДНК. Это помогает понять важные биологические процессы, такие как регуляция генов и репарация ДНК.
2.Взаимодействие белок-белок: Техника полезна для исследования взаимодействий между различными белками в клеточном контексте. Это способствует выяснению состава белковых комплексов, сигнальных путей и функций белков.
3.Посттрансляционные модификации (ПТМ): Вестерн-блоттинг позволяет обнаруживать и анализировать ПТМ — химические модификации, которые происходят после синтеза белка. Примеры ПТМ включают фосфорилирование, ацетилирование и гликозилирование. Оценка этих модификаций дает представление о активности и регуляции белков.
4.Обнаружение изоформ белков: Изоформы — это разные версии или варианты белка, возникающие в результате альтернативного сплайсинга или других механизмов. Вестерн-блоттинг может различать и количественно оценивать специфические изоформы, что позволяет изучать их функциональные различия и их роль в заболеваниях.
5.Характеризация антител: Вестерн-блоттинг полезен для оценки специфичности и чувствительности антител. Он может подтвердить их связывание с предполагаемой целью и подтвердить их пригодность для использования в различных экспериментальных процедурах.
6.Картирование эпитопов: Эпитопы — это специфические участки на антигене, которые распознаются и связываются с антителами. Вестерн-блоттинг может использоваться для идентификации и картирования этих эпитопов, что помогает в разработке антител и понимании взаимодействий антиген-антитело.
7.Субклеточная локализация белков: Используя специфические антитела, вестерн-блоттинг может определить субклеточную локализацию белков. Эта информация помогает понять распределение белков внутри клеток и их роли в различных клеточных компартментах.
Эти примеры являются одними из наиболее распространенных применений техники вестерн-блоттинга. Ее универсальность и способность предоставлять информацию о присутствии, взаимодействии, модификациях и локализации белков делают вестерн-блоттинг ценным инструментом в различных научных дисциплинах.
021-66840435
Менеджер по Продажам Отдела России и СНГ
+989101638848
Связаться с нами
