Что такое ПЦР (Полимеразная Цепная Реакция)?

ПЦР — это молекулярно-биологическая техника, которая позволяет амплифицировать (увеличивать количество копий) и идентифицировать ДНК и РНК-последовательности относительно простым образом. В отличие от традиционных методов клонирования и амплификации ДНК, требующих длительных процессов, ПЦР позволяет добиться того же результата всего за несколько часов. Благодаря высокой чувствительности ПЦР может обнаруживать и амплифицировать специфические последовательности даже с минимальными количествами матрицы. ПЦР применяется не только для базового обнаружения ДНК и РНК, но и как мощный инструмент для репликации генов или коротких сегментов ДНК. Изобретённый Кэри Маллисом, метод стал незаменимым в лабораториях для получения миллиардов копий ДНК для исследований и диагностики. Процесс ПЦР включает три этапа: денатурация, отжиг праймеров и удлинение праймеров. Используя два набора праймеров, комплементарных концам матрицы ДНК, и термостабильную ДНК-полимеразу, несколько циклов полимеризации приводят к созданию большого количества копий целевого сегмента ДНК.

Что такое qPCR (Количественная Полимеразная Цепная Реакция)?

Количественная ПЦР, также известная как qPCR или ПЦР в реальном времени, добавляет возможность количественного анализа ДНК или РНК в RT-qPCR. Главная особенность qPCR — возможность отслеживания амплификации в реальном времени во время самого процесса ПЦР благодаря использованию флуоресцентной маркировки, которая позволяет собирать данные в реальном времени. Как и ПЦР, qPCR использует флуоресцентные красители или пробы, связывающиеся с целевой ДНК во время амплификации. Эти пробы излучают свет на разных длинах волн при возбуждении лазером. Измеряя излучаемый свет на каждой длине волны, можно определить количество целевой ДНК, присутствующей в образце до амплификации. qPCR позволяет также непрерывно отслеживать процесс амплификации, фиксируя изменения флуоресценции со временем.

Что такое ОТ-ПЦР (Обратная Транскрипция с Полимеразной Цепной Реакцией)?

ОТ-ПЦР состоит из двух основных этапов: первый — процесс обратной транскрипции, а второй — амплификация желаемой последовательности ДНК с помощью ПЦР. ОТ-ПЦР используется для обнаружения РНК в образце, а её количество можно измерить с помощью RT-qPCR. ОТ-ПЦР в сочетании с qPCR (RT-qPCR) является очень полезной для количественного анализа вирусной РНК и анализа экспрессии генов. Этапы ОТ-ПЦР аналогичны этапам ПЦР, но с дополнительным первым этапом обратной транскрипции, на котором комплементарная ДНК (кДНК) сначала создаётся с помощью обратной транскриптазы, а затем используется как матрица для стандартного процесса амплификации ПЦР.

Чем Отличается Полимеразная Цепная Реакция, ПЦР с Обратной Транскрипцией и Количественная Полимеразная Цепная Реакция?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это базовый метод для создания множества копий определенных фрагментов ДНК. В отличие от неё, обратная транскрипция с ПЦР (ОТ-ПЦР) используется для амплификации РНК, а количественная ПЦР (qPCR) применяется для измерения количества нуклеиновых кислот в образце.
•    ПЦР и ОТ-ПЦР — качественные методы, тогда как qPCR — это количественный метод.
•    ПЦР использует в качестве исходной матрицы двухцепочечную ДНК, в то время как ОТ-ПЦР работает исключительно с РНК. В отличие от этого, qPCR может использовать как ДНК, так и РНК.
•    ПЦР имеет низкую чувствительность и специфичность по сравнению с ОТ-ПЦР и qPCR, которые демонстрируют высокую чувствительность и специфичность.
•    Разрешение амплифицированного продукта в ПЦР очень низкое, тогда как продукты, полученные с помощью ОТ-ПЦР и qPCR, обладают высоким разрешением.
•    Для традиционной ПЦР требуется только фермент ДНК-полимераза, тогда как для ОТ-ПЦР и qPCR необходимы как обратная транскриптаза, так и ДНК-полимераза.
•    ПЦР, как и ОТ-ПЦР, не связана с флуоресценцией, тогда как qPCR основана на принципе флуоресценции.
•    ПЦР и ОТ-ПЦР дают результаты только по завершении реакции, тогда как qPCR одновременно предоставляет результаты в виде пиков и графиков.