Как Работает Горизонтальный Гель-Электрофорез?

В генетике гель-электрофорез — это лабораторная методика, применяемая для разделения смесей, содержащих ДНК, РНК и другие белки, на основе их молекулярного размера и заряда. Для выполнения этого метода ДНК, РНК или белки пропускаются через гель с мелкими порами. Электрическое поле перемещает молекулы через гель.

Что такое Горизонтальный Гель-Электрофорез?

Горизонтальный гель-электрофорез разделяет молекулы ДНК, РНК или белков на основе их молекулярного размера и заряда с использованием геля в горизонтальной ориентации, погружённого в буфер. Гель-бокс делится на два отсека агарозным гелем, где на одном конце находится анод, а на другом — катод. При подаче тока создаётся градиент заряда, поддерживаемый буфером. При нагрузке гель нагревается, но буфер выполняет функцию охлаждающего агента, поддерживая оптимальную температуру. Рециркуляция рабочего буфера предотвращает образование градиента pH. Поскольку два отсека системы геля соединены рабочим буфером, использование дискретного буферного раствора невозможно.
Воздействие кислорода в гель-боксе запрещает использование акриламида в горизонтальном гель-электрофорезе. Кислород препятствует полимеризации акриламида, нарушая формирование геля. Горизонтальный гель-электрофорез — это простой метод разделения молекул ДНК и РНК.

Какое Оборудование и Материалы Необходимы для Проведения Гель-Электрофореза?

Для начала гель-электрофореза требуется набор основных инструментов. Несмотря на наличие различных типов гель-электрофореза, необходимое оборудование остаётся неизменным. Вот список того, что потребуется для выполнения гель-электрофореза:

Гель-бокс:

Гель-бокс для гель-электрофореза варьируется в зависимости от используемых типов гелей. Для разделения ДНК и РНК с агарозными гелями предпочтителен горизонтальный гель-электрофорез.

Гель:

Гель для гель-электрофореза может быть предварительно изготовленным или ручного изготовления. Он содержит лунки в верхней части, куда загружаются образцы перед их миграцией через гель. Гель погружается в рабочий буфер, содержащий ионы соли, которые способствуют проведению электрического тока через гель.

Рабочий буфер:

Заранее изучите, какой конкретный рабочий буфер требуется, и подготовьтесь соответствующим образом. Рабочие буферы можно приобрести, но их также можно приготовить в лаборатории в больших объёмах.

Источник питания:

Для подачи необходимого электрического тока используется источник питания, например, источник питания ДенаГен. Кабели подключаются к положительным и отрицательным клеммам гель-бокса, позволяя источнику питания подавать электрический ток.

Каковы Этапы Горизонтального Гель-Электрофореза?

Этап 1: Подготовка образца

Каждый эксперимент требует различных образцов, но все они должны быть подготовлены одинаковым образом перед проведением гель-электрофореза. Чтобы начать процесс, смешайте образцы с загрузочным буфером. Загрузочный буфер содержит краситель, который помогает видеть образец при загрузке и работе, а также глицерин для повышения плотности образцов. Более высокая плотность помогает образцам опуститься на дно лунок при загрузке, предотвращая их быстрое растекание.

Этап 2: Подготовка геля и буфера

Гель для электрофореза можно либо купить заранее подготовленный (pre-cast), либо изготовить в лаборатории (hand-cast). При подготовке геля необходимо учитывать такие факторы, как его состав, процентное содержание (влияющее на размер пор и разрешение разделения), количество и размер лунок.
Выберите подходящий тип рабочего буфера и подготовьте его заранее. Буферы можно приобрести, но их часто готовят в лаборатории в больших объёмах. Перед загрузкой образцов извлеките гребень из геля. Наполните гель-бокс рабочим буфером и поместите гель в бокс так, чтобы он был полностью покрыт буфером.

Этап 3: Загрузка и пипетирование образцов

Перед добавлением образцов определите оптимальный порядок их расположения на геле. С помощью пипетки аккуратно разместите образцы в отдельных лунках геля. Кроме того, в одну из лунок добавьте маркер с размерами (ladder) для дальнейшего анализа.

Этап 4: Проведение электрофореза (Работа с гелем)

После загрузки образцов закройте гель-бокс крышкой, подключите провода к источнику питания и запустите электрофорез. Настройте напряжение и продолжительность работы в соответствии с требованиями эксперимента.

Этап 5: Визуализация и фиксация полос

После завершения гель-электрофореза важно визуализировать полученные полосы ДНК, РНК или белков. Гели с ДНК можно визуализировать, добавив ДНК-краситель и исследовав их под УФ-светом. Для визуализации ДНК и РНК-блоттинга могут потребоваться дополнительные шаги. Белки можно визуализировать в геле с помощью методов, таких как двухмерный дифференциальный гель-электрофорез (2D-DIGE), но часто их требуется перенести с геля на мембрану для дальнейшего анализа. Цифровые устройства, такие как Azure Imagers, позволяют одновременно визуализировать и документировать результаты.