ПЦР (полимеразная цепная реакция) - это метод молекулярной биологии, применяемый для увеличения небольших участков ДНК или гена, что позволяет получить множество копий определенного сегмента ДНК из крошечного начального количества. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) впервые разработал в 1983 году американский биохимик Кэри Маллис, который в последствии был удостоен Нобелевской премии по химии в 1993 году за свои революционные достижения. Во время пандемии COVID-19 ПЦР использовалась как важная часть процедур тестирования для подтверждения наличия вируса у зараженных людей.
ПЦР, что означает полимеразную цепную реакцию, - это метод, используемый в медицинских и молекулярно-биологических исследованиях для получения большого количества копий, варьирующегося от тысяч до миллионов, определенного участка ДНК, такого как конкретный ген. Его применения разнообразны, включая начальные этапы обработки ДНК для секвенирования и создание судебных ДНК-профилей с использованием минимальных количеств ДНК. Кроме того, его можно использовать для обнаружения генов с целью помощи в идентификации патогенов во время инфекций. Например, во время пандемии COVID-19 тесты ПЦР использовались для определения наличия или отсутствия сегмента генетического материала вируса в пробе мазка у человека, предоставляя положительный или отрицательный результат инфекции.
1-ДНК-матрица, которая служит целью для репликации.
2-Праймеры, которые являются короткими отрезками ДНК или РНК, обычно длиной от 20 до 30 оснований. Эти праймеры связываются с обоими концами интересующего ДНК-региона, указывая начальную точку для ПЦР.
3-ДНК-нуклеотидные основания, также известные как dNTP, которые являются строительными блоками ДНК. Эти основания (А, Т, С и G) необходимы для конструирования новой ДНК-цепи во время ПЦР.
4-Так полимераза (Taq-полимераза), фермент, ответственный за добавление нуклеотидных оснований к реплицированной ДНК-последовательности.
5-Буферный раствор, создающий оптимальные условия для проведения реакции ПЦР.
1-Денатурация: Двухцепочечная матричная ДНК подвергается высоким температурам, что приводит к разделению на две одноцепочечные цепи.
2-Прижигание: Температура снижается, облегчая присоединение ДНК-праймеров к матричной ДНК.
3-Экстензия: Температура снова повышается, и фермент Так полимераза синтезирует новую цепь ДНК. Эти три стадии повторяются 20-40 раз, что приводит к удвоению копий ДНК на каждом цикле. Этот процесс, известный как термоциклирование, выполняется с помощью устройства, называемого термоциклером. В зависимости от скорости работы устройства, ПЦР может быть завершена менее чем за час или занять несколько часов. После завершения ПЦР может быть использована техника, называемая электрофорезом, для оценки количества и размера произведенных фрагментов ДНК.
• Во время этой стадии смесь реакции подвергается температуре 94-95⁰C примерно на 15-30 секунд.
• Повышенная температура приводит к нарушению водородных связей между основаниями в двух цепях матричной ДНК, вызывая разделение цепей.
• В результате образуются две отдельные цепи ДНК, которые служат матрицами для синтеза новых копий ДНК.
• Важно поддерживать температуру на этой стадии в течение достаточного времени для полного разделения цепей ДНК.
• На этой стадии реакция охлаждается для облегчения присоединения праймеров к определенному месту на одноцепочечной матричной ДНК за счет образования водородных связей.
• Температура, необходимая для прижигания, зависит от характеристик праймера и обычно составляет от 50 до 65⁰C.
• Две разделенные цепи ДНК являются комплементарными и ориентированы в противоположных направлениях, причем один конец является 5'-концом, а другой - 3'-концом. Следовательно, используются два праймера: прямой и обратный.
• Этот шаг имеет большое значение, поскольку праймеры устанавливают начальную точку для синтеза ДНК. Предоставляя короткий участок двухцепочечной ДНК, они позволяют ферменту полимеразы начать создание новой комплементарной цепи ДНК, используя доступные свободные основания ДНК на следующем этапе экстензии.
• Обычно этап прижигания длится примерно 10-30 секунд.
• Температура повышается до 72⁰C для облегчения синтеза новых цепей ДНК с использованием специализированного фермента, называемого Так-полимеразой, который добавляет ДНК-основания.
• Так-полимераза происходит от бактерии Thermus aquaticus, обычно известной как "Taq". Эта бактерия естественно обитает в горячих источниках и обладает термостабильностью при температурах свыше 80⁰C, оптимальная для нее температура составляет 72⁰C.
• Полимераза ДНК, извлеченная из этой бактерии, проявляет исключительную стабильность при высоких температурах, что позволяет ей выдерживать условия температуры, необходимые для разделения цепей ДНК во время стадии денатурации ПЦР.
• В отличие от этого, полимераза ДНК из большинства других организмов не смогла бы выдержать такие высокие температуры. Например, полимераза человека функционирует оптимально при 37˚C, что эквивалентно температуре тела.
• При температуре 72⁰C Так-полимераза начинает строить комплементарную цепь ДНК. Сначала она связывается с праймером, а затем последовательно добавляет ДНК-основания к одноцепочечной цепи в направлении от 5' к 3'.
• Этот процесс приводит к образованию совершенно новой цепи ДНК и в конечном итоге приводит к образованию двухцепочечной молекулы ДНК.
• Продолжительность этого шага варьируется в зависимости от длины усиливаемой последовательности ДНК. В среднем на репликацию 1000 оснований ДНК требуется примерно одна минута.
Продолжение Цикла
• Термоциклирование повторяется 20-40 раз, что позволяет получить множество копий желаемой последовательности ДНК.
• Новые синтезированные фрагменты ДНК, образованные во время каждого цикла, служат матрицами для присоединения фермента полимеразы ДНК, инициируя дальнейший синтез ДНК.
• Этот повторяющийся процесс приводит к образованию значительного количества копий целевого сегмента ДНК в относительно короткий промежуток времени.
ПЦР находит применение в различных областях биологии и медицины, включая молекулярно-биологические исследования, медицинскую диагностику и определенные направления экологии.
Результаты ПЦР обычно визуализируются с помощью техники, называемой гель-электрофорезом. Гель-электрофорез включает использование электрического тока для перемещения фрагментов ДНК через гель-матрицу, которая разделяет фрагменты по их размеру. Для определения размера фрагментов ДНК в образце ПЦР обычно используется стандарт, известный как "лестница ДНК".
021-66840435
Менеджер по Продажам Отдела России и СНГ
+989101638848
Связаться с нами
