انواع کیت‌های استخراج DNA

استخراج DNA فرآیندی است که به ظاهر ساده به نظر می‌رسد، اما در عمل کیفیت نهایی DNA و قابلیت اعتماد آن برای تست‌های حساس مانند PCR، qPCR یا NGS، به عوامل زیادی بستگی دارد. حتی کیت‌های استاندارد نیز می‌توانند نتایج متفاوتی ارائه دهند و گاهی ران‌ها ناکافی یا آلوده شوند، که مستقیما بر دقت و تکرارپذیری نتایج تأثیر می‌گذارد.

برای دستیابی به نتایج مطمئن، لازم است کیت‌ها بر اساس سه معیار ارزیابی شوند: کیفیت واقعی DNA استخراج‌شده، میزان خطاهای پنهان در مراحل لیز و شستشو، و سازگاری با تجهیزات دستی یا دستگاه‌های اتوماتیک. در این مقاله، با کیت‌های استخراج DNA و نکات عملی  انتخاب آن‌ها آشنا خواهید شد و خواهید دید که چگونه می‌توان DNA با کیفیت بالا و خلوص مناسب برای آزمایش‌های حساس به دست آورد.

همچنین با مزایای دستگاه تمام اتوماتیک استخراج DNA دناژن تجهیز آشنا می‌شوید؛ دستگاهی که سرعت فرآیند، دقت و تکرارپذیری نتایج را افزایش می‌دهد و اجرای فرآیند استخراج را آسان و مطمئن می‌کند. برای بهره‌مندی از مشاوره تخصصی و استعلام قیمت، از طریق راه‌های ارتباطی با ما ارتباط بگیرید.

کیت استخراج DNA چیست؟

کیت‌های استخراج DNA ابزارهای آماده‌ای هستند که فرآیند جداسازی اسید نوکلئیک از نمونه‌های بیولوژیکی مانند خون، بافت، سلول و مایعات بدن را استاندارد و قابل تکرار می‌کنند. تجربه عملی در آزمایشگاه نشان می‌دهد که کیفیت DNA استخراج‌ شده به شدت به نوع کیت، تکنولوژی مورد استفاده و تطابق آن با نمونه ورودی بستگی دارد. بنابراین آشنایی با انواع کیت های استخراج DNA و انتخاب مناسب‌ترین آن‌ها نقش تعیین‌کننده‌ای در به دست آوردن DNA با خلوص بالا و قابل اعتماد برای تست‌های حساس مانند PCR و qPCR دارد.

به طور مثال، یک نمونه خون EDTA در مقایسه با نمونه بزاق، نیازمند لیز قوی‌تر و مراحل شستشوی دقیق‌تر است تا DNA خالص و با کمترین آلودگی پروتئینی به دست آید. در بسیاری از آزمایشگاه‌ها مشکلات رایج شامل لیز ناکامل، باقی‌ماندن پروتئین یا DNA برشی است که روی نتایج PCR و qPCR تاثیر مستقیم دارد.

کیفیت پایین DNA می‌تواند به‌ طور مستقیم بر دقت و قابلیت اعتماد نتایج آزمایش‌های حساس تأثیر بگذارد.برای مثال، DNA با کیفیت پایین باعث افزایش Ct در qPCR می‌شود و در NGS منجر به از دست رفتن توالی‌های هدف می‌گردد. علاوه بر این، خطاهای انسانی در مراحل دستی مانند پیپت‌گذاری، تعویض بافر و سانتریفیوژ می‌توانند کیفیت نهایی DNA را به‌ شدت کاهش دهند و حتی با استفاده از کیت مناسب، اگر نمونه به‌درستی آماده نشود یا زمان‌بندی مراحل رعایت نشود، خروجی قابل اعتماد به دست نخواهد آمد.

تجربه ما در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و تشخیصی تیم دناژن نشان داده است که دستگاه‌های تمام اتوماتیک استخراج DNA  با استفاده از تکنولوژی مگنتیک‌ بید، این مشکلات را به حداقل می‌رسانند و امکان استخراج یکنواخت DNA با خلوص بالا از انواع نمونه‌ها را فراهم می‌کند.

اگر حجم نمونه‌های شما بالاست یا خلوص خروجی روی Ct نتایج تأثیر دارد، پیشنهاد می‌کنم به کمک یک دستگاه تمام اتوماتیک استخراج DNA، تست‌ها را با خطای کمتر و سرعت بیشتری اجرا کنید.

انواع کیت استخراج DNA بر اساس تکنولوژی

کیت‌های استخراج DNA بر اساس تکنولوژی به‌کار رفته به سه دسته اصلی تقسیم می‌شوند: مگنتیک بید، ستون سیلیکایی و روش فاز آلی. انتخاب درست انواع کیت های استخراج DNA نقش مستقیمی در کیفیت DNA استخراج‌ شده، خلوص محصول نهایی، سرعت فرآیند و سازگاری آن با تست‌های حساس مانند PCR، qPCR و NGS دارد و انتخاب مناسب می‌تواند تفاوت قابل توجهی در نتایج آزمایشگاهی ایجاد کند. مقاله تفاوت انواع کیت استخراج اسید نوکلئیک هم به صورت کامل و جامع این روش‌ها را مقایسه کرده است.

کیت‌های مگنتیک بید (Magnetic Beads)

کیت‌های مگنتیک بید (Magnetic Beads)، مانند کیت مورد استفاده در دستگاه استخراج DNA، با بهره‌گیری از ذرات مغناطیسی، DNA را از نمونه‌های بیولوژیک جدا می‌کنند.

در این روش، DNA به سطح ذرات مغناطیسی متصل شده و با شستشوی دقیق پروتئین‌ها و نمک‌ها، محصولی با خلوص بالا و yield پایدار تولید می‌شود. سازوکار علمی این کیت‌ها به گونه‌ای است که مراحل لیز، بایند، واش و الوشن به‌صورت اتوماتیک انجام می‌شود، بنابراین وابستگی به مهارت اپراتور کاهش یافته و خطای انسانی به حداقل می‌رسد. تجربه عملی در آزمایشگاه نشان داده است که DNA استخراج‌شده با کیت مگنتیک تقریباً عاری از آلودگی پروتئینی و نمک است و برای PCR، qPCR و NGS بسیار مناسب است، حتی در نمونه‌هایی با غلظت پایین مانند سرم، بزاق یا FFPE، yield یکنواخت و DNA با کیفیت قابل اعتماد حاصل می‌شود.

از نظر سرعت، اتوماسیون مراحل استخراج باعث کاهش زمان آماده‌سازی نمونه و امکان انجام چندین ران همزمان شده است. بدون آنکه کیفیت DNA کاهش پیدا کند. حساسیت این روش نسبت به آلودگی نیز بسیار پایین است، زیرا تماس مستقیم اپراتور با نمونه و پیپت‌زنی دستی به حداقل رسیده و خطر آلودگی متقاطع کاهش می‌یابد. حتی در محیط‌های high-throughput یا در استخراج چند ران متوالی، کیفیت DNA حفظ می‌شود و Ct نتایج qPCR قابل پیش‌بینی و یکنواخت خواهد بود.

نمونه‌هایی که با این روش بهترین عملکرد را دارند شامل خون، بافت‌های نرم و فیبروتیک، سواب دهانی، کشت سلول، ویروس و باکتری هستند. طبق تجربه ما در استخراج از خون با حجم بالا، ستون‌های سنتی سریعا اشباع شده و نیاز به مراقبت دقیق مراحل شستشو دارند، در حالی که کیت مگنتیک همراه با اتوماسیون، yield پایدار و نتایج یکنواخت ارائه می‌دهد. در بافت‌های سخت یا چربی‌دار، DNA به طور کامل استخراج شده و مراحل لیز و شستشو نیاز به نظارت کمتر دارند، و حتی نمونه‌های با غلظت پایین، به دلیل جذب مؤثر DNA به ذرات مغناطیسی، برای واکنش‌های حساس آماده می‌شوند.

مطالعات نشان داده‌اند که روش استخراج مبتنی بر ذرات مغناطیسی (Magnetic Bead) می‌تواند جداسازی DNA را با خلوص و بازده بالا انجام دهد و به دلیل حذف مراحل پیچیده سانتریفیوژ، ذخیره زمان و کاهش خطاهای انسانی در آزمایشگاه‌های با حجم کاری بالا مناسب‌تر است. همچنین این تکنولوژی برای اتوماسیون فرایندها و افزایش تکرارپذیری نتایج بسیار مناسب است.

طبق مقاله ای از ژورنال nature داریم:

“We report a magnetic silica bead-based nucleic acid extraction method which is rapid (6–7 min) and efficient (extracts nearly all the nucleic acid in the sample). We call this method SHIFT-SP (Silica bead based High yield Fast Tip based Sample Prep). We have compared the method developed here to commercially available bead and column-based methods.”

 

در این مطالعه گزارش شده است که تکنولوژی‌های جدید مبتنی بر ذرات سیلیکا‑مگنتیک در استخراج نوکلئیک‌اسید، زمان استخراج را به‌طور قابل توجهی کاهش داده و بازده را در مقایسه با روش‌های سنتی ستونی افزایش می‌دهند، که این مزیت برای آزمایشگاه‌های دارای حجم بالا اهمیت دارد.

طبق مشاهدات من در آزمایشگاه تحقیقاتی بایولوژی، استفاده از کیت‌های مگنتیک بید همراه با دستگاه اتوماتیک استخراج DNA، تفاوت چشمگیری در کیفیت و تکرارپذیری DNA ایجاد کرد. هنگام استخراج DNA از نمونه‌های خون با حجم بالا، ستون‌های سنتی سریعا اشباع می‌شدند و نیاز به نظارت دقیق مراحل شستشو داشتند، اما با کیت مگنتیک، yield پایدار و خلوص بالا به دست آمد و Ct نتایج qPCR کاملا یکنواخت بود. همچنین در نمونه‌های سخت یا چربی‌دار، مانند بافت‌های فیبروتیک یا FFPE، DNA به طور کامل استخراج شد و مراحل لیز و شستشو بدون خطای انسانی انجام گرفت. این تجربه نشان داد که استفاده از تکنولوژی مگنتیک به همراه اتوماسیون، نه تنها سرعت فرآیند را افزایش می‌دهد، بلکه حساسیت نسبت به آلودگی و خطای اپراتور را به حداقل می‌رساند و برای آزمایشگاه‌های با حجم کاری بالا و نمونه‌های متنوع، انتخابی مطمئن است.

کیت‌های ستون سیلیکایی (Silica Column DNA Extraction Kits)

کیت‌های ستون سیلیکایی، DNA را با جذب به سطح سیلیکای ستون از سایر اجزای نمونه جدا می‌کنند. DNA پس از اتصال به ستون، با استفاده از بافرهای شستشو پاک‌سازی می‌شود و در مرحله نهایی با بافر الوشن (elution) جمع‌آوری می‌شود. این روش به دلیل مکانیزم جذب فیزیکوشیمیایی ساده، در آزمایشگاه‌های استاندارد، کاربرد گسترده دارد.
در آزمایشگاه مشاهده شده که DNA استخراج‌ شده با ستون سیلیکایی در حجم کم و نمونه‌های خون تازه، کیفیت قابل قبولی دارد و برای PCR و qPCR قابل استفاده است. با این حال، در نمونه‌های بافتی فیبروتیک یا حاوی چربی، ستون‌ها به سرعت clog می‌شوند و DNA ممکن است به‌ طور کامل استخراج نشود. همچنین، در مدت زمان طولانی نگهداری یا در طی چندین مرحله پیپت‌گذاری، DNA ممکن است degrade شود و خلوص کاهش پیدا کند.
سرعت استخراج با ستون سیلیکایی در مقایسه با روش‌های مبتنی بر مگنتیک متوسط است و هر ران به دقت اپراتور وابسته است. تجربه عملی نشان داده که پیپت‌گذاری مکرر، تعویض بافر و دستکاری ستون در مقیاس بزرگ می‌تواند باعث آلودگی متقاطع (cross-contamination) شود و DNA به‌ طور کامل و تمیز جمع‌آوری نشود. بنابراین در محیط high-throughput، این روش محدودیت‌های قابل توجهی دارد.

کیت‌های ستون سیلیکایی برای تست‌های PCR و qPCR با حجم نمونه کم مناسب هستند و DNA خروجی معمولا خلوص کافی دارد. با این حال، در پروژه‌های با تعداد نمونه زیاد و یا نیاز به NGS، مشکلاتی مانند clog ستون، degrade DNA و حساسیت بالای روش به مهارت اپراتور می‌تواند نتایج را ناپایدار کند.

هنگامی که برای اولین بار استخراج DNA از نمونه‌های خون با حجم بالا را انجام می‌دادم، متوجه شدم که ستون‌های سیلیکایی به سرعت اشباع می‌شوند و بدون دقت کافی در مراحل شستشو، خلوص DNA به شدت کاهش می‌یابد. در ادامه، هنگام کار با بافت‌های فیبروتیک، با مشکل لیز ناکامل مواجه شدم و بخش قابل توجهی از DNA روی ستون باقی ماند، که باعث کاهش چشمگیر yield شد. در محیط آزمایشگاه‌های high-throughput، اجرای چند ران متوالی استخراج، خستگی اپراتور را افزایش داده و احتمال خطای انسانی را بالا می‌برد. از طرف دیگر، نمونه‌های کوچک خون یا بافت‌های نرم به خوبی پاسخ دادند و DNA یکنواخت و قابل اعتماد ارائه کردند، در حالی که نمونه‌های چربی‌دار یا بافت‌های سخت نیاز به دقت، زمان و مراقبت بیشتری داشتند تا نتایج قابل اتکا حاصل شود.

روش فاز آلی (Organic Phase)

روش فاز آلی، که معمولا شامل Phenol-Chloroform Extraction است، بر اساس تفاوت حلالیت DNA و پروتئین‌ها در فازهای آبی و آلی عمل می‌کند. در این روش، DNA به فاز آبی منتقل می‌شود و پروتئین‌ها و سایر اجزای سلولی در فاز آلی باقی می‌مانند، که این سازوکار علمی امکان تولید DNA با خلوص نسبی بالا را فراهم می‌کند. بااین‌حال، کیفیت DNA به دقت اپراتور در اجرای مراحل Back Extraction و جداسازی فازها وابسته است. کوچک‌ترین خطا می‌تواند باعث باقی ماندن فنول یا پروتئین شود و خلوص و yield DNA را کاهش دهد.

از نظر سرعت، روش فاز آلی زمان‌بر است و شامل چندین مرحله جداسازی و انتقال فاز می‌شود، بنابراین محدود به حجم نمونه‌های کم بوده و برای محیط‌های high-throughput مناسب نیست. همچنین حساسیت این روش به آلودگی بالا است. تماس مستقیم اپراتور با نمونه و پیپت‌زنی مکرر می‌تواند باعث آلودگی متقاطع یا کاهش کیفیت DNA شود.

در زمینه کاربرد برای PCR، qPCR و NGS، این روش محدودیت‌هایی دارد. در نمونه‌های کوچک و آزمایش‌های پایه‌ای برای PCR و qPCR قابل استفاده است، اما برای NGS تنها زمانی مناسب است که نیاز به DNA بسیار خالص و کنترل‌شده باشد و حجم نمونه محدود باشد. تجربیات عملی نشان می‌دهد که نمونه‌های با غلظت پایین DNA، نمونه‌های FFPE یا کشت سلولی پیچیده، معمولا با این روش به سختی استخراج می‌شوند و yield ناپایدار است.

در مجموع، روش فاز آلی بیشتر برای تحقیقات پایه یا نمونه‌های خاص توصیه می‌شود و در شرایط کنترل‌شده می‌تواند DNA با خلوص بالا تولید کند، اما در آزمایشگاه‌های مدرن با حجم کاری بالا یا نیاز به اتوماسیون، جایگزین‌های مبتنی بر مگنتیک یا ستون سیلیکایی عملکرد بهتر، تکرارپذیری بالاتر و سرعت بیشتری ارائه می‌دهند.

در تجربه عملی من در استخراج DNA از نمونه‌های بافتی کوچک با روش فاز آلی، مشخص شد که مراحل Back Extraction نیاز به دقت بسیار بالایی دارند و هر اشتباه جزئی می‌تواند منجر به باقی ماندن فنول و کاهش خلوص DNA شود. سرعت فرایند پایین و زمان‌بر بودن آن، به‌ ویژه در ران‌های متعدد، محدودیت ایجاد می‌کند. بااین‌حال، DNA به‌ دست‌ آمده برای PCR پایه قابل استفاده بود، اگرچه این روش برای نمونه‌های پیچیده یا حجم بالا مناسب نیست. این تجربه نشان داد که روش فاز آلی بیشتر برای نمونه‌های خاص و تحقیقات پایه کاربرد دارد و در محیط‌های high-throughput یا آزمایشگاه‌های نیازمند اتوماسیون محدودیت دارد.

چگونه مناسب‌ترین کیت را انتخاب کنیم؟

انتخاب کیت استخراج DNA باید براساس هدف آزمایش، نوع نمونه و حجم کاری آزمایشگاه انجام شود تا هم کیفیت DNA و هم تکرارپذیری نتایج تضمین شود. اگر هدف شما انجام PCR یا qPCR است، کیت‌های ستون سیلیکایی گزینه‌ای مطمئن هستند، زیرا DNA خالص و یکنواختی ارائه می‌دهند که برای واکنش‌های آنزیمی حساس ضروری است.

در آزمایشگاه‌هایی که حجم نمونه روزانه بالا است، کیت‌های مگنتیک مزیت‌های قابل توجهی دارند: سرعت بالاتر استخراج، کاهش خطای انسانی و سازگاری کامل با سیستم‌های اتوماتیک. تجربه عملی نشان داده است که تکرار استخراج‌های متعدد با روش دستی می‌تواند باعث خستگی اپراتور و افزایش خطا شود، اما ترکیب کیت مگنتیک با دستگاه اتوماتیک، مانند دستگاه استخراج DNA دناژن تجهیز، هم بازده و خلوص DNA را پایدار نگه می‌دارد و هم Ct قابل اعتماد در qPCR را تضمین می‌کند.

برای آزمایشگاه‌هایی که روزانه PCR یا تست‌های تشخیصی انجام می‌دهند، اتوماسیون استخراج DNA یک ضرورت است. دستگاه تمام‌اتوماتیک دناژن تجهیز امکان استخراج دقیق و یکنواخت DNA از نمونه‌های مختلف را فراهم می‌کند و زمان اپراتور را آزاد می‌کند تا روی تحلیل و طراحی تست‌ها تمرکز کند، بدون اینکه کیفیت DNA کاهش یابد.

بررسی‌های مقایسه‌ای علمی نشان می‌دهند که انتخاب روش استخراج (به‌ویژه بین تکنولوژی‌های مبتنی بر ستون سیلیکایی و روش‌های مبتنی بر ذرات مگنتیک) تأثیر قابل‌ توجهی بر خلوص، بازده و کیفیت نوکلئیک‌اسید استخراج‌ شده دارد و این تفاوت‌ها می‌تواند به‌ طور مستقیم بر نتایج مراحل بعدی مانند PCR یا توالی‌یابی اثر بگذارد.

اگر به دنبال کاهش خطای انسانی، افزایش سرعت استخراج و حفظ کیفیت DNA در آزمایشگاه‌هایی هستید که روزانه PCR یا تست‌های تشخیصی انجام می‌دهند، اتوماسیون استخراج DNA یک راهکار حیاتی است.