واکنش PCR

PCR مخفف Polymerase Chain Reaction به معنای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز است. این تکنیک، تحولی در زیست‌شناسی مولکولی ایجاد کرد. در حقیقت فرآیند PCR امکان تکثیر و شناسایی یک قطعه خاص از DNA را در محیط آزمایشگاه فراهم می‌کند. با استفاده از واکنش PCR می‌توان از یک نسخه DNA، میلیون‌ها تا میلیاردها نسخه مشابه را در مدت زمان کوتاهی تولید کرد. این قدرت تکثیر، PCR را به ابزاری حیاتی در زمینه‌های مختلف علوم زیستی، پزشکی و تحقیقاتی تبدیل کرده است.

فرآیند PCR چیست؟

PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز) یک تکنیک آزمایشگاهی تشخیص مولکولی است که برای تکثیر سریع و آسان یک قطعه خاص از DNA استفاده می‌شود. این فرایند توسط دستگاهی به نام ترموسایکلر(Thermal Cycler) انجام می شود. ترموسایکلر مانند یک دستگاه فتوکپی مولکولی عمل می‌کند و به دانشمندان اجازه می‌دهد تا از یک نسخه کوچک DNA، میلیون‌ها یا حتی میلیاردها نسخه مشابه بسازند.

اجزای اصلی واکنش PCR

برای انجام موفقیت‌آمیز فرآیند PCR، وجود اجزای زیر ضروری است:

DNA الگو (Template DNA):

توالی DNA هدف برای تکثیر و همانندسازی

آغازگرها (Primers):

قطعات کوتاه DNA تک‌رشته‌ای مکمل نواحی هدف که همانندسازی را آغاز می‌کنند.

نوکلئوتیدهای آزاد (dNTPs):

واحدهای سازنده DNA شامل: A, T, C, G 

آنزیم Taq پلی‌مراز(Taq Polymerase):

این آنزیم کاتالیزور سنتز DNA جدید است.

بافر واکنش:

این بافر محیط شیمیایی مناسب برای واکنش را فراهم می‌کند.

مراحل انجام PCR چگونه است؟ 

فرآیندPCR  شامل چرخه‌های متوالی گرم و سرد کردن است که هر چرخه از سه مرحله اصلی تشکیل شده است:

دناتوراسیون (Denaturation)

o    هدف این مرحله: جدا کردن دو رشته DNA الگو از یکدیگر برای آغاز همانندسازی
o    دمای دناتوراسیون: بالا (معمولاً 94-98 درجه سانتیگراد).
در این دما، پیوندهای هیدروژنی بین دو رشته DNA شکسته می شود و DNA به صورت تک‌رشته‌ای در می‌آید تا به عنوان الگو برای ساخت رشته‌های جدید مورد استفاده قرار بگیرد.

اتصال آغازگرها (Annealing)

o    هدف: اتصال پرایمرها به توالی‌های مکمل خود در DNA تک‌رشته‌ای الگو.
o    دمای اتصال آغازگرها: پایین‌تر (معمولاً 50-65 درجه سانتیگراد)، بسته به نوع طراحی پرایمر.
o    پرایمرها: قطعات کوتاه DNA تک‌رشته‌ای هستند که به طور اختصاصی برای نواحی ابتدایی و انتهایی قطعه DNA هدف طراحی می‌شوند. اتصال صحیح پرایمرها برای تکثیر ناحیه مورد نظر و انجام واکنش ضروری است.

کشش یا سنتز رشته جدید (Extension)

o    هدف این مرحله: ساخت رشته‌های جدید DNA مکمل با استفاده از آنزیم DNA پلیمراز.
o    دمای کشش یا سنتز: دمای بهینه برای فعالیت آنزیم Taq polymerase (معمولاً 72 درجه سانتیگراد).
آنزیم Taq polymerase شروع به افزودن نوکلئوتیدهای مکمل به رشته DNA الگو می‌کند و رشته DNA جدید را می سازد. در پایان این مرحله، تعداد مولکول‌های DNA دو برابر می‌شود.
این چرخه های ترموسایکلر سه مرحله‌ای معمولاً 25 تا 35 بار تکرار می‌شود و در هر چرخه، مقدار DNA هدف به صورت نمایی یا تصاعدی افزایش می‌یابد.

محصولات PCR برای تایید تکثیر قطعه DNA مورد نظر و بررسی آن، مورد آنالیز قرار می گیرند. برخی از روش‌های رایج برای آنالیز محصولات PCR عبارتند از: استفاده از ژل الکتروفورز، طیف سنجی، فلورسانس، تعیین توالی DNA و هضم آنزیمی. انتخاب روش مناسب برای آنالیز محصولات PCR به هدف آزمایش، تجهیزات موجود و میزان دقت مورد نیاز بستگی دارد.