تکنیک PCR و نکاتی کلیدی درباره آن

تکنیک PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز) یکی از مهم‌ترین و پرکاربردترین روش‌ها در زیست‌شناسی مولکولی است که برای تکثیر بخش‌های خاصی از DNA به کار می‌رود. این روش با استفاده از آنزیم DNA پلی‌مراز، دمای بالا و پرایمرها، امکان تولید میلیاردها نسخه از یک قطعه کوچک DNA را در مدت زمان کوتاهی فراهم می‌کند. نکات کلیدی در این تکنیک شامل انتخاب دقیق پرایمرها برای اختصاصیت بالا، تنظیم مناسب دمای آنیلینگ برای جلوگیری از اتصالات غیر اختصاصی، و مدیریت مناسب چرخه‌های دمایی در دستگاه ترموسایکلر است که تأثیر مستقیمی بر کیفیت و دقت نتایج دارد.

آیا ترموسایکلر و PCR یکسان هستند؟

پاسخ سوال آیا ترموسایکلر و pcr یکسان هستند؟ کلمه خیر است. در واقع ترموسایکلر (Thermo Cycler)یا ترمال سایکلر (Thermal Cycler) دستگاهی است که تکنیک PCR در آن انجام می شود. ترموسایکلر به صورت سیکلیک دما را تغییر می دهد و موجب انجام واکنش PCR می شود. PCR یک تکنیک invitro می باشد که برای تشخیص هدفمند قطعات DNA به کار می رود.

در صورت تمایل می توانید راهنمای خرید دستگاه ترموسایکلر را مطالعه نمایید. این راهنما به صورت دقیق شما را در انتخاب یک دستگاه PCR مناسب راهنمایی می کند.

بهترین دمای annealing برای یک واکنش PCR کدام است؟

در واقع دمای Annealing برای پی سی آر بستگی به طول پرایمر درصد GC و اختصاصیت آن دارد. این عدد بین 50 تا 68 درجه سانتی‌گراد است و باید 5 تا 7 درجه کمتر از دمای ذوب پرایمرها باشد. البته نکته ای که لازم است در نظر گرفته شود این است که کامل به نتایج بدست آمده از نرم افزارهای طراحی پرایمر اطمینان نکنید. بهتر است با دستگاه گرادیان ترموسایکلر اقدام به پیدا کردن دمای بهینه Annealing پرایمرها کنید. جهت تلفیق نتایج به‌دست‌آمده با نرم‌افزار، بهتر است دمای بهینه نرم‌افزار را به‌عنوان مرکزیت تعریف شیب دمایی جهت انجام PCR گرادیان اعمال کنید. مطمئناً موافق این موضوع هستید که به‌دست‌آوردن دمای بهینه Annealing به‌صورت آزمایشگاهی بهتر از دمای بهینه annealing به­دست ­آمده با نرم‌افزار به‌تنهایی است.

چرا mgcl2 در تکنیک PCR استفاده می شود؟

یونهای منیزیم به صورت mgcl2 به مستر میکس PCR افزوده می ­شوند. این یونها در واقع کوفاکتور آنزیم پلیمراز در طی واکنش پی سی آر هستند. در صورتی که مقدار این یون کم باشد موجب ایجاد نتایج تکثیر ضعیف یا حتی به طور کامل صورت نگرفتن واکنش PCR می باشد. اما درصورتی‌که زیاد باشد؛ به علت اتصال غیراختصاصی پرایمرها موجب خطای تکثیر غیراختصاصی باندها می‌شود. این امر موجب ایجاد باندهای بیشتر در الکتروفورز آگارز می­شود.

چرا نمی توان در واکنش PCR از RNA استفاده کرد؟

این امر به دلیل اختصاصی بودن DNA Polymerase می باشد. در واقع DNA Polymerase از اتصالات DNA دورشته­ای ایجاد و تک رشته ای DNA جهت تکثیر استفاده می کند. به­ همین دلیل باید درصورتی‌که لازم به تکثیر RNA باشد، ابتدا آن را به cDNA  تبدیل کرد. سپس در واکنش PCR به تکثیر آن پرداخته ­شود.

نکته دیگری که دررابطه با RNA قابل ذکر است و لزوم تبدیل آن به cDNA  را نشان می دهد، تجزیه شدن سریع آن توسط آنزیم های RNAse موجود در محیط است.

تاچ دان PCR چیست و چه کاربردی در تکنیک PCR دارد؟

تاچ دان PCR یا PCR تاچ دان یک روش پی سی آر است که به منظور جلوگیری از تکثیر قطعات غیراختصاصی طراحی شده است. دمای Annealing طی واکنش PCR تعیین کننده اختصاصیت اتصال پرایمرها می ­باشد. در این روش دمای ذوب پرایمرها  بالاتر از دمای Annealing ست می ­شود. در این دمای بالاتر از دمای ذوب جفت شوندگی تنها بین پرایمر و رشته الگو ایجاد خواهد شد. به دلیل ماهیت تکثیر نمایی در PCR ، اتصال غیر اختصاصی موجب  پایین آوردن شدید کیفیت نتایج PCR می ­شود.

همانگونه که شمای زیر نشان می دهد، مکانیسم کار بدین گونه است که در ابتدا با دماهای بالای Annealing موجب تکثیر کاملا اختصاصی قطعات DNA مد نظر شده و در سیکل های بعد دمای انیلینگ را کاهش داده تا احتمال تکثیر افزایش یابد. اما اتفاقی که همزمان می افتد کاهش احتمال تکثیر قطعات غیراختصاصی است. 

درواقع می ­توان اینگونه بیان کرد که تاچ دان PCR نوعی گرادیان پی سی آر است. در تاچ دان PCR کل بلاک ها در یک گرادیان دمایی در دمای انیلینگ قرار دارند. بنابراین اگر دستگاه ترموسایکلر از مدل معمولی باشد، می تواند خاصیت تاچ دان داشته باشد.