pcr چیست؟

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) از مهم ترین نوآوری‌ها در زیست شناسی مولکولی است. PCR یک روش برای تکثیر DNA است که با تغییر دما یا Thermocycling در چند مرحله انجام می‌شود. برای انجام PCR ، از دستگاه pcr که نقش بسیار حیاتی دارد، استفاده می‌شود. ترموسایکلر قادر است دمای نمونه‌های DNA را به‌ طور دقیق و خودکار تغییر دهد. کنترل دما و تکرار سریع این مراحل باعث می‌شود مقادیر بسیار کم DNA در مدت کوتاهی به میلیون‌ها نسخه برسد.

در این مقاله، به اصول PCR، اجزای آن، مراحل انجام واکنش، کاربردهای گسترده و نکات عملی وآزمایشگاهی برای اجرای موفق، می‌پردازیم. برای تضمین موفقیت PCR خود، نکات آزمایشگاهی تست‌ شده توسط کارشناسان دناژن، در ادامه مقاله را از دست ندهید.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) چیست؟

PCR روشی برای ساختن نسخه‌های فراوان از یک ژن یا یک بخشی از ژنتیک است. در این روش، ماده ژنتیکی در چرخه‌های حرارتی باز و بسته می‌شود و آنزیم DNA پلیمراز، واحدهای سازنده آن را اضافه می‌کند تا رشته‌های جدید ساخته شود.

کاربرد PCR

PCR توانایی تکثیر مقادیر بسیار کم ژنتیک، سرعت فوق‌العاده بالا و کاربرد در حوزه‌های بسیار گسترده‌ای دارد. از جمله کاربرد‌ها می‌توان به:

1.  تشخیص بیماری‌های عفونی: مانند HIV، CMV، مایکوپلاسما، پنومونی، سرطان، سیفلیس، بیماری‌های قارچی و پروتوزوآیی، هپاتیت
2. تشخیص سرطان، به‌ویژه لوسمی و لنفوم‌ها
3. اثر انگشت ژنتیکی و تعیین آزمایش پدری

محدودیت‌  PCR   

طبق اطلاعاتی که از سایت Danaher Life Sciences موجود است، گفته می‌شود که PCR محدودیت‌هایی هم دارد:

The length of the PCR amplified product is limited by the size of the polymerase enzyme used in the reaction which is typically 2–5 kb. Accordingly, PCR may not be practically suitable for amplifying very large DNA fragments.

طول محصولی که در PCR تکثیر می‌شود، به اندازه‌ی آنزیم DNA پلیمرازی که در واکنش استفاده می‌شود محدود است و این مقدار معمولا در حدود ۲ تا ۵ کیلوباز است. بنابراین PCR از نظر عملی برای تکثیر قطعات بسیار بزرگ DNA مناسب نیست.

اجزای اصلی PCR

همان طور که در مقاله  Polymerase Chain Reaction توضیح داده شده، برای انجام PCR به چند جز اساسی نیاز است که عبارت‌ هستند از:

• الگوی DNA یا cDNA: این الگو شامل ناحیه‌ای از DNA است که قرار است تکثیر شود.
• دو آغازگر (Primer): آغازگرها محدوده‌ی شروع و پایان ناحیه هدف را تعیین می‌کنند.
• آنزیم Taq پلیمراز: آنزیمی که ناحیه هدف را کپی می‌کند.
• نوکلئوتیدها (Nucleotides): بلوک‌های سازنده DNA که توسط DNA پلیمراز برای سنتز رشته‌ی جدید استفاده می‌شوند.
• بافر (Buffer) شامل MgCl₂: محیط شیمیایی مناسب برای فعالیت آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می‌کند.

چه زمانی PCR شکست می‌خورد؟

 شکست PCR زمانی در آزمایشگاه اتفاق می‌افتد که محصول مورد نظر به‌ درستی ساخته نشده است و یا این که نتیجه غیرقابل استفاده باشد. عوامل مختلفی می‌توانند باعث شکست PCR شوند. اما یکی از مهم‌ترین و رایج‌ترین دلایل، طراحی پرایمرها و نحوه چسبیدن آن‌ها به DNA است. بسیاری از شکست‌ها به این مرحله مربوط می‌شوند.

طراحی نادرست پرایمر‌ باعث می‌شود:

•  به بخش اشتباه DNA متصل شوند.
•  ساختارهای پیچیده مانند hairpin (حلقه‌ای که پرایمر خودش در رشته خود می‌سازد) تشکیل دهند.
• با دمای اتصال یا آنيلینگ (Annealing: دمایی که پرایمر به DNA می‌چسبد) سازگار نباشند.

 MgCl₂ و بافر دومین ابزار کلیدی هستند که تاثیر زیادی در موفقیت یا شکست PCR دارند. به دلیل این که کمک می‌کنند پلیمراز، پرایمر و الگو در شرایط صحیحی با یکدیگر برهم کنش داشته باشند.

اصول پایه واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بر چند اصل کلیدی مبتنی است که هماهنگی دقیق دما، زمان و اجزای واکنش را ممکن می‌کند. آشنایی با این اصول، پایه درک عملکرد صحیح و موفقیت PCR در آزمایشگاه است.

کنترل دقیق دما

دما در PCR نقش کلیدی دارد. دما تعیین می‌کند که آیا دو رشته DNA  به هم متصل شده‌اند یا از هم جدا شده‌اند. دمای مناسب باعث می‌شود پرایمر در جای درست متصل شود و از اتصال به بخش‌های اشتباه جلوگیری می‌کند. همچنین از تشکیل ساختارهای ثانویه (مثل حلقه یا دو رشته‌ای‌های غیرطبیعی) جلوگیری می‌کند.

 اگر دمای واکنش به‌خوبی تنظیم نشود، مراحل به‌ درستی انجام نمی‌شود و یا به‌ طور کامل متوقف می‌شود. درنتیجه کنترل دقیق چرخه حرارتی توسط دستگاه ترموسایکلر در آزمایشگاه نقش حیاتی دارد.

ماهیت نمایی

این واکنش یک فرآیند نمایی است. در هر چرخه PCR، مقدار محصول تقریبا دو برابر می‌شود. بنابراین هر اشتباه یا آلودگی کوچک در مراحل اولیه آزمایش می‌تواند در چرخه‌های بعد به‌ صورت نمایی تکثیر شود و بخش بزرگی از محصول نهایی را تشکیل دهد. PCR به دقت و پایداری واکنش بسیار حساس است.

اختصاصیت وابسته به پرایمر

اختصاصیت PCR (این‌که کدام بخش از ژنوم تکثیر شود) توسط پرایمرها تعیین می‌شود. دستگاه ترموسایکلر هدف را تغییر نمی‌دهد. در واکنش اگر میزان حرارت دقیق و پایدار نباشد یا اگر دستگاه دارای نوسان دما، توزیع نادرست یا دارای مشکل در لوله‌ها باشد، حتی پرایمر خوب هم ممکن است به‌ درستی عمل نکند و محصول نامناسب، نتیجه واکنش ما باشد.

 شرکت دناژن تجهیز به‌عنوان یک تولید کننده دانش‌بنیان با واحد تحقیق‌ و‌توسعه و تولید داخلی، ترموسایکلرهای تخصصی با کنترل دقیق دما و تکرارپذیری بالا را برای اجرای PCR تولید می‌کند. اگر نتایج PCR شما ناپایدار است، ممکن است مشکل از دستگاه باشد. برای مشاوره خرید دستگاه pcr می‌توانید با کارشناسان ما در ارتباط باشید.

اهمیت تکرار‌پذیری

تکرارپذیری مهم‌تر از یک بار جواب گرفتن است.  PCR واقعی یعنی در تمامی روزها توسط همه اپراتورها، همان نتیجه را از واکنش داشته باشیم. کوچک‌ترین اختلاف در روش، دما، مواد یا کار با دستگاه می‌تواند محصول نهایی را تغییر دهد.

مراحل انجام واکنش پلیمراز

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک فرآیند چرخه‌ای است که بر پایه تغییرات دقیق دما عمل می‌کند. در هر چرخه، مراحل انجام PCR به‌صورت منظم تکرار می‌شوند. با گذر از چندین چرخه، حتی مقدار بسیار کمی از ماده ژنتیکی اولیه می‌تواند به حجم قابل توجهی برای بررسی و تحلیل تبدیل شود.

مرحله دناتوراسیون (Denaturation)

دناتوراسیون از اولین و حساس‌ترین مرحله در چرخه PCR است. در این مرحله DNA دو‌رشته‌ای با استفاده از حرارت بالا از یکدیگر جدا می‌شوند تا هر رشته حاصل، که به آن DNA تک‌ سنج (single-stranded DNA) گفته می‌شود، به‌ صورت مستقل و به‌عنوان الگو برای مراحل بعدی واکنش آماده شود.

دمای دناتوراسیون

دمای دناتوراسیون در بازه 94 الی 98 درجه سانتی‌گراد تنظیم می‌شود تا پیوندهای هیدروژنی بین جفت‌ بازهای DNA شکسته شوند و دو رشته به‌ طور کامل از یکدیگر جدا شوند. پرایمرها تنها می‌توانند به DNA باز متصل شوند و DNA پلیمراز، در حضور این الگو قادر به سنتز رشته جدید است.

مشکلات رایج در دناتوراسیون

در صورتی که دناتوراسیون به‌ طور کامل انجام نشود، پرایمرها به‌ درستی متصل نخواهند شد و PCR از همان ابتدا دچار اختلال می‌شود. در عمل آزمایشگاهی، موفقیت مرحله دناتوراسیون تنها به تنظیم عدد دما وابسته نیست، بلکه دقت و یکنواختی واقعی دما در بلاک حرارتی بسیار مهم است.

در ترموسایکلرهای ضعیف یا ناپایدار، دمای واقعی نمونه‌ها ممکن است با دمای تنظیم‌ شده اختلاف داشته باشد. تجربه آزمایشگاهی نشان داده است که حتی اختلاف ۱ تا ۲ درجه سانتی‌گراد می‌تواند منجر به باز شدن ناقص DNA و در نهایت ایجاد باند ضعیف یا فقدان کامل محصول PCR شود. در همین مرحله می‌توان متوجه کیفیت بلاک حرارتی ترموسایکلر شد. این بلاک حرارتی با حفظ دمای یکنواخت خیال آزمایشگاه را از انجام کامل مرحله دناتوراسیون راحت می‌کند.

مرحله اتصال پرایمر (Annealing)

مرحله آنیلینگ دومین مرحله چرخه PCR است که در آن پرایمرها به‌ طور متوالی به DNA الگو متصل می‌شوند و نقطه شروع سنتز رشته جدید را مشخص می‌کنند. در این مرحله دمای واکنش کم می‌شود و معمولا حدود ۳ تا ۵ درجه سانتی‌گراد کمتر از دمای ذوب پرایمرها (Tm) تنظیم می‌شود تا اتصال پایدار برقرار شود.

دمای آنیلینگ و ارتباط آن با Tm پرایمر

دمای آنیلینگ نقش بسیار مهمی در موفقیت PCR دارد. اگر دما بیش از حد بالا باشد، پرایمرها نمی‌توانند به DNA  متصل شوند و در نتیجه محصول هدف به‌خوبی تکثیر نمی‌شود یا سیگنال بسیار ضعیف می‌دهد. اگر دما بسیار پایین باشد، پرایمرها ممکن است در بخش نادرستی قرار بگیرند و باعث ایجاد محصولات ناخواسته مانند پرایمر-دایمر شوند که باعث کاهش کیفیت نتیجه می‌شود.

مشکلات رایج در آنیلینگ

تجربه عملی نشان می‌دهد که بسیاری از شکست‌های PCR نه به کیت یا پرایمر، بلکه به عدم دقت یا ناپایداری دمای آنیلینگ در دستگاه ترموسایکلر مربوط می‌شوند. حتی تغییرات جزئی دما یا تغییر دستگاه‌ها می‌تواند نتیجه واکنش را به‌ طور محسوسی تغییر دهد.

نتایج ناسازگار PCR می‌تواند هزینه‌بر و زمان‌بر باشد. اگر می‌خواهید از تکرارپذیری و پایداری نتایج مطمئن شوید، با کارشناسان فنی دناژن تماس بگیرید تا با مشاوره تخصصی، مدل مناسب ترموسایکلر، با توجه به حجم کاری و نیازهای آزمایشگاهی شما پیشنهاد دهند. جزئیات کامل این موارد در صفحه راهنمای خرید ترموسایکلر موجود است.

مرحله گسترش (Extension)

سومین مرحله اصلی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، مرحله گسترش است. در این مرحله، آنزیم DNA پلیمراز، رشته جدید را می‌سازد اما فقط زمانی که پرایمرها به درستی به DNA متصل شوند. در مرحله گسترش، دما به مقداری می‌رسد که آنزیم مقاوم به حرارت (مانند Taq polymerase) فعال شود و بتواند نوکلئوتیدها را به رشته DNA اضافه کرده و رشته‌ای جدید بسازد.

ارتباط زمان گسترش با طول DNA

زمان در این مرحله بسیار حائز اهمیت هستند زیرا مدت زمان این مرحله به طول DNA مورد نظر بستگی دارد. برای مثال، آنزیم Taq polymerase معمولا حدود ۱ دقیقه برای هر ۱ کیلوباز DNA نیاز دارد تا رشته جدید را کامل بسازد. اگر زمان کمتر باشد، DNA ناقص ساخته می‌شود و محصول کامل PCR در آزمایشگاه حاصل نمی‌شود.

دمای بهینه مرحله گسترش

دمای بهینه این مرحله برای بیشتر پلیمرازهای مقاوم به حرارت حدود 72 درجه سانتی‌گراد است. در این دما آنزیم بیشترین سرعت و کارایی را دارد. اگر دما خیلی پایین باشد، فعالیت آنزیم کند می‌شود و اگر خیلی بالا باشد، آنزیم آسیب می‌بیند یا عملکرد آن کاهش می‌یابد.

عوامل موفقیت مرحله گسترش

مطابق اطلاعات سایت mybiosource اگرچه DNA پلیمراز مسئول ساخت رشته جدید DNA است اما موفقیت مرحله گسترش، تنها به آنزیم وابسته نیست. عوامل مهم دیگر عبارتند از:

•  کیفیت و غلظت الگوی DNA
• طراحی و غلظت آغازگرها (Primers)
• غلظت یون‌های منیزیم (Mg²⁺)
• غلظت چهار نوکلئوتید (dNTPs)
• نوع سیستم بافر مورد استفاده در PCR
• انتخاب و غلظت DNA پلیمراز
•  شرایط چرخه‌های دمایی PCR

Ramp Rate  در PCR

در PCR، دستگاه دما را بین مراحل تغییر می‌دهد و سرعت تغییر دما یا Ramp Rate را مشخص می‌کند که چقدر سریع نمونه به دمای مناسب هر مرحله برسد.

• Ramp Rate بالا: نمونه سریع‌تر به دمای گسترش می‌رسد و زمان کل PCR کوتاه‌تر می‌شود.
•  Ramp Rate پایین: رسیدن به دما آهسته‌تر است، که در نمونه‌های پیچیده می‌تواند به اتصال بهتر پرایمر کمک کند.

تاثیر Ramp Rate بر کیفیت

Ramp Rate می‌تواند روی کارایی، سرعت و تکرارپذیری PCR تأثیر مستقیم داشته باشد. انتخاب یک ترموسایکلر با کنترل دقیق دما و Ramp Rate مناسب یکی از عوامل کلیدی موفقیت واکنش است.

تکنیک PCR در عمل چگونه انجام می‌شود؟

 (PCR) یک تکنیک استاندارد آزمایشگاهی است که برای تکثیر یک بخش خاص از DNA استفاده می‌شود. این روش با چرخه‌های حرارتی کنترل‌ شده و سه مرحله اصلی (دناتوراسیون، اتصال پرایمرها و گسترش DNA ) تعداد نسخه‌های هدف را به‌صورت نمایی افزایش می‌دهد.

تفاوت PCR روی کاغذ و PCR در آزمایشگاه

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز روی کاغذ و در متون علمی PCR به‌ صورت تئوری توضیح داده می‌شود. مراحل دناتوراسیون، آنیلینگ و اکستنشن با دما و زمان دقیق انجام ‌شود و فرض بر این است که شرایط ایده‌آل است.

اما موفقیت PCR در عمل و آزمایشگاه، به عوامل متعددی مانند کیفیت کیت و مواد، دقت دمایی، زمان‌ بندی چرخه‌ها و مهارت اپراتور بستگی دارد. حتی اختلاف جزئی دما یا خطای اپراتور می‌تواند باعث ایجاد باندهای غیر‌اختصاصی شود و درمواردی محصول مورد‌نظر ما تولید نشود.

نقش اپراتور و دستگاه در PCR

موفقیت PCR تا حد زیادی به مهارت فرد اجرا کننده در آزمایشگاه بستگی دارد. برای مثال:

•  آماده‌سازی و استخراج نمونه DNA
• طراحی و انتخاب پرایمر مناسب
•  تنظیم دقیق دما، زمان و برنامه چرخه حرارتی
• کار با میکروپیپت و جلوگیری از آلودگی

بدون رعایت این موارد، حتی بهترین ترموسایکلر هم نمی‌تواند نتیجه مطلوب دهد.

نقش دستگاه، اجرای دقیق برنامه حرارتی مانند کنترل دمای هر مرحله، تغییر سریع بین دماها (Ramp Rate) و ایجاد یکنواختی دما در تمام لوله‌ها است. وجود یک دستگاه پایدار و دقیق باعث کاهش خطاهای حرارتی و اجرای صحیح تمامی مراحل می‌شود.

اهمیت تکرارپذیری PCR

تکرارپذیری یعنی نتایج یکسان را در روزهای مختلف یا توسط افراد مختلف داشته باشیم. مراحل PCR  موفق، تنها گرفتن یک نتیجه نیست؛ بلکه تکرار مرتب یک نتیجه واحد است.

بدون تکرارپذیری، حتی اگر یک بار نتیجه محصول مناسب به دست آمده باشد، نتایج PCR ارزش علمی و عملی نخواهند داشت.

نقش دستگاه ترموسایکلر در موفقیت PCR

بخش ضروری اجرای دقیق  PCR چرخه‌های حرارتی است که توسط ترموسایکلر انجام می‌شود و موفقیت آن تنها به مواد شیمیایی و آنزیم‌ها بستگی ندارد. این دستگاه میزان حرارت را در هر مرحله به‌ طور دقیق کنترل می‌کند و کنترل دقیق دما باعث می‌شود واکنش حساس‌تر، اختصاصی‌تر و همچنین تکرارپذیر باشد.

نتایج PCR بدون ترموسایکلر دقیق، به‌طور کامل غیرقابل اعتماد هستند. از جمله پارامتر‌های مهم دستگاه می‌توان به یکنواختی دما، سرعت Ramp، دقت سنسورها و ظرفیت نمونه اشاره کرد. ترموسایکلرهای گرادینت 64 خانه و ترموسایکلر با گرادینت 32 خانه ظرفیت‌های متفاوتی دارند که هر کدام کاربرد مختص خودشان را دارند.

مطابق اطلاعات منتشر شده در سایت pub med مطالعات نشان می‌دهند که:

Among the factors which have to be optimized to ensure highest sensitivity and specificity of the polymerase chain reaction (PCR) is the processor which enables the automatic performance of the PCR assay. It has to guarantee temperature homogeneity for all samples of an individual run and run‑to‑run comparability.

یکی از عواملی که باید برای حصول بالاترین حساسیت و اختصاصیت در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) بهینه شود، قسمت دستگاه پردازشگر (Thermal cycler) است که عملکرد خودکار واکنش PCR را انجام می‌دهد. این دستگاه باید یکنواختی دما را برای همه نمونه‌های یک چرخه و همچنین بین چرخه‌های مختلف تضمین کند.

ترموسایکلر خوب چه مشکلی را حل می‌کند؟

ترموسایکلر، دستگاهی بسیار فراتر از یک دستگاه حرارت‌ دهی ساده است. باعث کاهش نرخ شکست، تکرارپذیری، حذف آزمون ‌وخطای پرهزینه و همچنین صرفه‌جویی در کیت و زمان واکنش آزمایشگاهی می‌شود. اگر با نتایج ناپایدار PCR مواجه هستید، ممکن است مشکل از دستگاه شما باشد، برای کاهش Fail-Rate و افزایش تکرارپذیری، قبل از هر تصمیمی با متخصصان این حوزه مشورت کنید. شما می‌توانید با شماره کارشناس فروش ما هم تماس بگیرید تا به صورت کامل شما را راهنمایی کنند.

چرا تکنیک PCR روی دستگاه‌های مختلف نتایج متفاوتی دارد؟

PCR بسیار وابسته به کیفیت سخت‌ افزار است. هر ترموسایکلر روش متفاوتی برای کنترل دما و رسیدن به دمای هدف آزمایشگاهی دارد و همین تفاوت‌ها باعث می‌شود برنامه PCR روی دستگاه‌های مختلف نتایج متفاوتی دهد. حتی اختلاف کوچک دما بین بخش‌های مختلف بلوک حرارتی می‌تواند اثر منفی روی اتصال پرایمرها یا عملکرد آنزیم داشته باشد.

خطاهای رایج در PCR

PCR تکنیکی است که به کوچک‌ترین خطاها حساس است. از جمله خطاهای رایج می‌توان به :

1.  ندادن باند (No Band)، بعد از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز اشاره کرد که اغلب به دلیل درست طراحی نشدن پرایمر، دما، چرخه نامناسب، مقدار یا کیفیت DNA است.
2.  باند غیر‌اختصاصی یا نامطلوب، ممکن است به دلیل وصل شدن پرایمر به بخش اشتباه باشد یا دما اتصال پرایمر پایین باشد.
3.  آلودگی نیز از جمله خطاهای رایج است. زیرا حساسیت PCR بسیار بالا است و حتی مقدار کمی DNA محیطی یا PCRهای قبلی می‌تواند نتایج اشتباه بدهد.
4.  تکرارپذیری پایین هم از عوامل موثر در این خطاها هستند.

چه آزمایشگاه‌هایی به ترموسایکلر حرفه‌ای نیاز دارند؟

وجود دستگاه‌های حرفه‌ای در آزمایشگاه‌هایی مانند آزمایشگاه‌های پزشکی قانونی برای تعیین هویت DNA، شناسایی نمونه‌های بیولوژیک و تحلیل‌های حقوقی ضروری است. در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی مانند زیست‌ شناسی مولکولی و ژنتیک و آزمایشگاه‌های تشخیص عفونی و سلامت عمومی برای تست‌های بالینی یا مراکز تحقیق و توسعه در داروسازی کاملا ضروری است. در واقع این مدل انتخاب مناسبی برای پروژه‌های تحقیقاتی، توسعه کیت، طراحی پرایمر و آزمایشگاه‌هایی است که دقت و سرعت توسعه پروتکل برایشان اولویت دارد. ترموسایکلر با گرادیان دمایی 64 مناسب این آزمایشگاه‌ها است.

PCR دقیقا در کدام مرحله دچار مشکل می‌شود؟

دناتوراسیون و اتصال پرایمر بیشترین میزان مشکل و خرابی (حدود 70 درصد) را بر عهده دارند. همان‌طور که اشاره کردیم در دناتوراسیون اگر دما یا زمان کافی نباشد، دو رشته DNA به‌ طور کامل جدا نمی‌شوند. حدود 20 درصد نوسان دمایی دستگاه و حدود 10 درصد وجود خطای انسانی باعث ایجاد مشکل و خرابی درنتایج آزمایشگاهی می‌شود.

چه زمانی باید به فکر تعویض یا خرید ترموسایکلر باشید؟

ترموسایکلر جزو تجهیزات با عمر مفید محدود است و خرید یا تعویض یک دستگاه جدید زمانی مطرح می‌شود که عملکرد و دقت آن دیگر نتایج قابل‌ اعتماد PCR را تضمین نکند. در زمان‌هایی که نتایج بین اپراتورها فرق دارد، PCR فقط در بعضی ران‌ها جواب می‌دهد یا کیت‌های مختلف نتایج متناقض می‌دهند و حتی هنگام وجود مشکلات سخت افزاری مانند افزایش مکرر خرابی‌ها و هزینه‌های تعمیر، تعویض یا خرید ترموسایکلر اجتناب ناپذیراست.

جمع‌بندی 

PCR یکی از حساس‌ترین و قدرتمندترین روش‌ها برای تکثیر DNA است که موفقیت آن تنها به کیت و پرایمر محدود نمی‌شود. نوسان دمایی، یکنواخت نبودن بلاک حرارتی یا Ramp Rate نامناسب حتی با بهترین معرف‌ها می‌تواند باعث شکست یا ناپایداری نتایج واکنش آزمایشگاهی شود. اگر با تکرارپذیری پایین، باندهای ضعیف یا نتایج متناقض PCR رو به‌ رو هستید، زمان آن رسیده است که عملکرد ترموسایکلر خود را بررسی کنید. انتخاب یک ترموسایکلر دقیق و قابل اعتماد، علاوه بر کاهش Fail-Rate، باعث صرفه‌جویی در زمان، کیت و هزینه‌های آزمایشگاه می‌شود و کیفیت نتایج شما را به سطحی حرفه‌ای ارتقا می‌دهد.