تکنیک وسترن بلاتینگ
این روش که به ایمونوبلاتینگ نیز معروف است بر پایه واکنش اولیه آنتی بادی-آنتی ژن می باشد. در این روش پس از بلاتینگ پروتئین ها، ابتدا مناطق آزاد غشا مسدود می شود (مرحله بلوکه کردن). سپس شرایط واکنش آنتی بادی (برای مثال سرم بیمار) با باندهای پروتئینی فراهم می گردد و به دنبال آن، با استفاده از ماکرومولکول های نشان دار (برای مثال آنتی بادی ضد ایمونوگلوبولین انسان که به آنزیم متصل است) نتیجه واکنش اولیه معلوم می گردد. امروزه وسترن بلاتینگ را به طور گسترده در تشخیص طبی و تحقیقات بکار می برند. اگرچه انجام این روش تابع یک سری اصول کلی است، با این حال شرایط و جزئیات آن وابسته به هدف آزمایش است.
تشخیص اختصاصی پروتئین ها در غشا
تشخیص یا رنگ آمیزی اختصاصی باندهای پروتئینی در غشا، بر پایه واکنش آنها با لیگاندهای اختصاصی صورت می گیرد. برای انجام این کار مولکولهای لیگاند را به طور مستقیم (اولیه) و یا غیرمستقیم (ثانویه) با مواد رادیواکتیو، فلورسانس، مواد رنگی یا آنزیمها نشان دار میکنند و با کمک آنها به تشخیص اختصاصی پروتئین ها می پردازند. آنتی بادیها از پر استفاده ترین لیگاندهای اختصاصی هستند که به اهداف مختلف تشخیص اختصاصی پروتئین ها می پردازند. اساس روش ایمونوبلاتینگ که اهمیت آن بر محققین علوم زیستی آشکار است، موید چنین ادعایی است.
مرحله مسدودسازی
غشاهای مورد استفاده در بلاتینگ ظرفیت زیادی برای گرفتن پروتئین ها دارند (برای مثال 100 میکروگرم در هر سانتی متر مربع از غشای نیتروسلولز) دارند. این خصوصیت اگرچه در جای خود بسیار مطلوب است ولی با اتصال غیر اختصاصی پروتئین های نشان دار در مراحل بعدی آزمایش به بروز اختلال در تشخیص منجر می شود. از این رو باید مناطق آزاد غشا قبل از مراحل تشخیص مسدود گردد. بهترین راه مسدودکردن این مناطق آزاد استفاده از پروتئین هایی است که خود با مواد نشان دار (مثل آنتی بادی) واکنش نمی دهد. کم هزینه بودن و سهولت تهیه از معیارهای اصلی انتخاب پروتئین مسدود کننده است. در جدول زیر نام و غلظت کاری تعدادی از پروتئین های مسدودکننده آمده است. دترجنت ها نیز میتوانند از اتصال پروتئین ها به غشا جلوگیری کنند.توین-20 معمولترین دترجنت مورد استفاده در این کار است. باید این نکته را توجه کرد که توین -20 در غلظتهای بالا (بیش از نیم درصد) در پارهای موارد از اتصال لیگاند به پروتئین نیز جلوگیری می کند.
تشخیص با آنتی بادی
پس از بلاتینگ پروتئین ها و بلوکه کردن غشا، مرحله تشخیص اختصاصی را می توان انجام داد. همانگونه که قبلا نیز گفته شد ایمونوبلاتینگ در بسیاری از موارد به هدف تشخیص طبی است. در این موارد باندهای انتقال یافته شامل همه یا بخشی ازپروتئین های پیکره میکروب (باکتری، ویروس یا قارچ) است که وجود یا عدم وجود آنتی بادی ضد سرم آنها در سرم انسان یا حیوان بررسی
می گردد. شناسایی با استفاده از آنتی بادی ها مانند تکنیک الایزا به دو روش صورت می گیرد: مستقیم و غیر مستقیم. در تکنیک مستقیم آنتی بادی اولیه که جهت تشخیص آنتی ژن مورد استفاده قرار می گیرد، با استفاده از یک آنزیم و یا رنگ فلوئورسنت نشان دار شده است. اما در تکنیک غیرمستقیم، ابتدا یک آنتی بادی اولیه به منظور اتصال به آنتی ژن افزوده می شود. سپس آنتی بادی ثانویه که به صورت نشان دار شده است، افزوده می شود. مولکول بیوتین جهت اتصال استفاده می شود و پروبهای فلوئورسنتی مانندفلوئورسئین و یا رودآمین و کانژوگه های آنزیمی مانند HRP یا آلکالین فسفاتاز برای شناسایی و تولید سیگنال مورد استفاده
قرار می گیرند. شکل زیر اصول کلی این دو نوع تکنیک ایمونوبلاتینگ را نشان می دهد.
هدف تشخیص داده می شود. در قسمت B به صورت غیر مستقیم
مولکول هدف شناسایی می شود.
مواد ایمونوبلاتینگ
1- بافر تریس نمکی با PH 7.5 (TBS). این بافر شامل تریس 20 میلی مولار و کلریدسدیم 15/0مولار است.
2- بافر تریس نمکی حاوی توین 05/0 درصد (TBS-T). به هر لیتر از بافر تریس نمکی 5/0 میلی لیتر توین- 20
اضافه شود.
3- آنتی بادی اولیه (سرم بیمار یا حیوان ایمن شده). در صورت لزوم با TBS-T رقیق می گردد.
4- آنتی بادی ثانویه . این آنتی بادی ضد بخش ثابت آنتی بادی اول است و با آنزیم (پراکسیداز) کونژوگه شده است. رقت مورد نیاز از این آنتی بادی در TBS-T تهیه می شود.
5- محلول سوبسترای آنزیم پراکسیداز شامل دی آمینو بنزیدین 5/0 میلی گرم در میلی لیتر و پراکسید هیدروژن 1/0 درصد در TBS
است.
روش آزمایش ایمونوبلاتینگ
1- پس از مرحله مسدودسازی، غشا را 3 بار، هربار 5 دقیقه در TBS-Tبشویید. سپس 1-2 ساعت در آنتی بادی اول قرار دهید.
2- غشا را 4 بار هر بار 5 دقیقه در TBS-T بشویید. سپس 1-2 ساعت در آنتی بادی ثانویه (آنتی بادی کانژوگه با پراکسیداز) قرار
دهید.
3- غشا را 4 بار هر بار 5 دقیقه در TBS-T بشویید. سپس آن را در معرض مقدار کافی از محلول سوبسترا قرار دهید. ظهور باندها
معمولا 5-15 دقیقه طول می کشد. پس از ظهور باندها غشا را در آب مقطر زیاد بشویید. غشا را خشک کرده، در محل تاریک قرار دهید.
توجه شود که دی آمینوبنزیدین یک ماده بسیار سمی است. از تماس با آن خودداری کنید و در استفاده از آن دقت نمایید.
نکات مهم تکنیک وسترن بلات
1- اگر می خواهید تعداد زیادی از نمونه های سرم را بررسی کنید. برای صرفه جویی در زمان و مواد می توانید غشای نیتروسلولز یا PVDF را به صورت نوارهای طولی به عرض 5/0 سانتی متر ببرید و هر نواری را برای بررسی یک نمونه سرم در لوله آزمایش جداگانه ای قرار دهید. برای انجام چنین کاری باید در هنگام الکتروفورز، نمونه گذاری در تمام عرض ژل متراکم کننده صورت گیرد. بدان معنی که ژل متراکم کننده بدون قرار دادن شانه منعقد می شود و در سرتاسر سطح آن نمونه گذاری صورت می گیرد. نتیجه الکتروفورز در چنین حالتی وجود باندهای پیوسته پروتئین در تمام عرض ژل می باشد.
2- تیتر آنتی بادی های کانژوگه به عواملی همچون خلوص آنتی بادی و آنزیم، روش کانژوگه نمودن و خالص سازی و غلظت کانژوگه بستگی دارد. آنتی بادی کانژوگه را معمولا 1000-10000 بار رقیق می کنند و مورد استفاده قرار می دهند. رقت مناسب رقتی است که کنترل مثبت را به وضوح مشخص می سازد و حداقل واکنش با زمینه غشا داشته باشد.
3- پراکسیداز پر استفاده ترین آنزیم در تهیه کانژوگه آنزیمی است. آلکالین فسفاتاز، گلوکز اکسیداز، اوره آز و پنیسیلیناز از دیگر آنزیم هایی هستند که با این هدف بکار می روند.
